响应面优化复合酶制备中华蜂蛹活性肽工艺研究

 张国良

 广西工商职业技术学院（南宁530007）

摘要  以中华蜂蛹为原料，研究复合酶制备中华蜂蛹蛋白肽的工艺。以中华蜂蛹蛋白肽的肽得率为参考指标，确定了木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶添加顺序和添加比例。采用单因素法确定酶解最佳工艺参数，响应面法优化复合酶酶法制备中华蜂蛹蛋白肽的工艺条件。研究结果表明，制备中华蜂蛹蛋白肽的最佳工艺条件为：木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶添加比例按酶活力比2:1同时添加，酶用量4 503.5 U/g，底物浓度4.5%，pH 8.3，酶解温度59.9℃，在该工艺条

件下中华蜂蛹蛋白肽的肽得率可达65.2%。

关键词  中华蜂蛹；蛋白肽：酶解；肽得率；响应面法

  中华蜂，又称中华蜜蜂、中蜂、土蜂，为东方蜜蜂的一个亚种，是中国独有的蜜蜂当家品种，也是以杂木树为主的森林群落及传统农业的主要传粉昆虫。蜂蛹含有丰富的人体所需的营养成分，是优良的营养来源。蛋白肽是中华蜂蛹的有效成分。研究表明蛋白肽能降血压、增强机体免疫能力、抗氧化和抗菌等。目前，我国动物蛋白水解物的研究主要集中食用价值高的肉体部分，因此，用酶法制备中华蜂蛹蛋白肽具有重要的意义。利用响应面分析法对中华蜂蛹蛋白肽的制备条件进行优化，以期为中华蜂蛹的综合利用提供理论基础。

1材料及方法

1.1原料与试剂

  中华蜂蛹：采集于当地中华蜂养殖基地；硅藻土：实验室提供；木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶：广州华美试剂有限公司；三氯乙酸、福林一酚试剂、凯氏定氮试剂：东莞信惠试剂有限公司。

1.2试验仪器与设备

  WDJ系列漩涡式粉碎机：上海百申仪器设备有限公司；KDN-1000全自动凯氏定氮仪：上海惠谱仪器有限公司；GT10-1高速离心机：东莞普生仪器厂；GZX-9070 MBE电热恒温鼓风干燥箱：东莞华生仪器厂；SZCL-2A型恒温磁力搅拌器：杭州市佳华仪器有限公司；HH-WO电热恒温水浴锅：广州嘉华仪器有限公司；GTR16-2高速冷冻离心机：上海百申仪器设备有限公司；等。

1.3试验方法

1.3.1  酶解工艺流程

1.3.2  中华蜂蛹蛋白肽的测定

 TCA法（三氯乙酸可溶性氮法）测定肽得率：将15%三氯乙酸与蛋白酶水解液1：1混合，离心(5 000 r/min，15 min)，取上清液采用福林一酚法测其可溶性氮。

（凯氏定氮法测定），mg。

1.3.3确定复合酶添加顺序

  酶解条件为酶活力比1：1，酶用量4 500 U/g，底物浓度5%，pH 8.0，酶解温度55℃。

 1)酶添加顺序为先添加木瓜蛋白酶后添加碱性蛋白酶。

 2)同时添加木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。

 3)先添加碱性蛋白酶后添加木瓜蛋白酶。

 以肽得率为指标确定酶的添加顺序。

1.3.4确定复合酶添加比例

 木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶按酶活力比为3:1，2：1.1：1，0：1，1：0，1：2和1:3添加，两种酶同时添加，其他同1.3.3。

1.3.5复合酶制备中华蜂蛹蛋白肽条件的优化

 通过单因素试验考察酶用量、底物浓度、pH和酶解温度对中华蜂蛹蛋白肽制备效果影响，在选取各因素的最优试验范围，采用响应面分析法对中华蜂蛹蛋白肽制备条件进行优化。

2结果与分析

2.1木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶添加顺序对中华蜂蛹蛋白肽肽得率的影响

 由图1可知，当木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶同时添加(b)时，肽得率较高。这是因为两种酶彼此之间存在协同作用，提高了肽得率。故选择木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的添加顺序为同时添加。

2.2木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶添加比例对中华蜂蛹蛋白肽肽得率的影响

 由图2可知，木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶以2:1活力比添加时的肽得率较高，高于按其他比例或者单独添加某种酶的肽得率。故选择木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的添加比例为2:1。

2.3复合酶制备中华蜂蛹蛋白肽条件的优化

2.3.1酶用量对中华蜂蛹蛋白肽制备效果的影响

 设定底物浓度为5%，pH 8.0，酶解温度为550C，分别在酶用量为3 900，4 100，4 300，4 500，4 700和4 900 U/g六个梯度下，按方法1.3.1制备中华蜂蛹蛋白肽。由图3可以看出，酶用量应控制在4 500 U／g左右较为适宜。

2.3.2底物浓度对中华蜂蛹蛋白肽制备效果的影响

 设定酶用量4 500 U/g，pH 8.0，酶解温度为550C，分别在底物浓度为1%，3%，5%，7%，9%和11%六个梯度下，按方法1.3.1制备中华蜂蛹蛋白肽。由图4可以看出，底物浓度控制在5%左右较为适宜。

2.3.3 pH对中华蜂蛹蛋白肽制备效果的影响

  设定酶用量4 500 U/g，底物浓度为5%，酶解温度为55℃，分别在pH为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0六个梯度下，按方法1.3.1制备中华蜂蛹蛋白肽。由图5可以看出，pH应制在8.0左右较为适宜。

2.3.4酶解温度对中华蜂蛹蛋白肽制备效果的影响

  设定物酶用量4 500 U/g，底物浓度为5%，pH8.0，分别在酶解温度为50℃，55℃，60℃，65℃．70℃和75℃六个梯度下，按方法1.3.1制备中华蜂蛹蛋白肽。由图6可以看出，酶解温度应控制在60℃左右较为适宜。

2.3.5中华蜂蛹蛋白肽制备条件的优化试验

  在单因素试验的基础上，选取酶用量，底物浓度，pH，酶解温度各因素的最优试验范围，按照表1的因素水平表，以中华蜂蛹蛋白肽肽得率为响应值，采用响应面分析法对中华蜂蛹蛋白肽制备条件进行优化。试验结果，回归方程图及响应面方差分析结果见表2和表3。

  根据中华蜂蛹蛋白肽制备的试验结果，由响应面分析法得出关于中华蜂蛹蛋白肽肽得率的二次回归拟合方程：

  其中：A为酶用量，B为底物浓度，C为pH，D为酶解温度。

 对中华蜂蛹蛋白肽制备的试验结果进行多元回归分析，由回归方程各项的方差分析结果（表3）可以看出，模型的F直为26 458.53，p<0.000 1，表明模型极显著，同时A酶用量，B底物浓度，C pH和D酶解温度都是显著因素，A酶用量与B底物浓度，C pH交互作用都显著；B底物浓度与C pH和D酶解温度的交互作用也都显著；C pH与D酶解温度的交互作用也显著。而失拟项的F=1.30，p=0.367 1，说明了该模型与中华蜂蛹蛋白肽制备实际情况拟合程度比较好，可以预测中华蜂蛹蛋白肽制备最佳条件。即酶用量4 503.5U/g，底物浓度4.5%，pH 8.3，酶解温度59.9℃。

3结论

 复合酶添加顺序为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶同时添加。而且，木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的添加比例为2：1。

 中华蜂蛹蛋白肽制备最佳工艺条件为酶用量4 503.5 U/g，底物浓度4.5%，pH 8.3，酶解温度59.9℃。在该工艺条件下中华蜂蛹蛋白肽的肽得率可达65.2%。