康文瀚1，田洪磊1，程卫东1，詹萍1，王军2，武强2
1．石河子大学食品学院（石河子832000）；2．石河子开发区合旭科技有限公司（石河子832000）
摘要利用响应面分析法优化糙米发芽富集y-氨基丁酸的工艺参数，分析得出最佳条件下糙米发芽富集y-氨基丁酸的含量。糙米发芽是糙米富集y-氨基丁酸的一种形式，通过单因素试验确定出糙米发芽的发芽率，利用纸层析法测量，测量y-氨基丁酸的含量。最佳的富集条件是：浸泡温度为30℃，浸泡时间为24 h，发芽温度30℃，发芽时间为28 h。
关键词发芽糙米；y-氨基丁酸；纸层析；响应面分析
y-氨基丁酸（简称GABA）是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质。约30%的中枢神经突触部位以GABA为递质。GABA在人体大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑中起重要作用，并对机体的多种功能具有调节作用。其作为一种存在于人类大脑中的氨基酸，是神经的主要抑制性传达物质，亦存在于番茄、葡萄、蜜桔、土豆、茄子等水果蔬菜中。研究发现，发芽的糙米内亦含有较高的GABA，其作用能较好地缓解精神压力，调节情绪，恢复身心健康，同时能缩短入睡时间和延长深睡眠时间，健脑，降血压，镇定神经，改善脂肪代谢，防止动脉硬化等。
GABA自2009年被国家批准为新资源食品后，以其独特的功能性和广泛的适用范围，成为国内外饮料生产厂商在开发新产品、增加产品附加值、强化产品功能性等方面一个重要的研究课题和发展思路，拥有广阔的市场前景。
通过了单因素试验先确定了以发芽率为参照标准的糙米发芽的最适条件，并采用纸层析法测量优秀发芽率中GABA的含量，最后基于响应面分析测定发芽糙米中GABA含量从而确定出富集GABA的最佳发芽条件。
1材料与方法
1.1试剂、仪器与设备
糙米：市售；GABA标准品：上海宝曼生物科技有限公司；无水乙醇、正丁醇、冰乙酸、硫酸铜等均为国产分析纯。
HSQ-3恒温水浴锅：上海智域分析仪器制造公司；721分光光度计：上海第三仪器分析厂；MK-200高速粉碎机：南京威利朗食品机械有限公司：ZXSD-1 160全自动新型生化培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；Neofuge15R高速冷冻离心机：利康发展有限公司；KQ-200VDE超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。
1.2试验方法
1.2.1发芽糙米的制备
在糙米去除谷壳后，进行人工精选去杂，以去除虫蛀、霉变、异色粒和未成熟粒，无胚米及石头等杂质，去杂后先用自来水冲洗3遍，洗去表面的糠粉和灰尘，沥干后，用0.12 mol/L的次氯酸钠溶液消毒25min，再用纯净水冲洗3遍；取经过前处理的糙米置于烧杯中，加入糙米10倍的水，并放人恒温水浴锅中浸泡，设置不同的温度；浸泡一段时间后，取出糙米，用水清洗，并铺于的培养皿中，盖上保鲜膜，戳破几个小孔透气，将培养皿置于恒温恒湿培养箱（恒温，相对湿度为95%）中，培养不同的时间；将按设定时间进行浸泡和发芽后的糙米迅速取出，用纯净水冲洗3遍后，再用75℃～80℃的热水进行灭酶处理10 min。将水沥干待用；将沥干水后的发芽糙米平铺到纸上，放入恒温培养箱中( 30℃)中，干燥3h得到发芽糙米。其制备工艺流程为：
1.2.2发芽糙米中GABA的提取
将干燥后的发芽糙米，准确称取干重为10.0 kg的糙米样品，研磨成均浆后定容至50 m L，于80℃水浴5 min待酶灭活后，温度降至室温后超声提取2h，将提取液转入离心管，置于离心机内，以8 000 r/min的转速离心10 min．取上清液为待测液。1.2.3糙米发芽条件对其发芽率及GABA含量的响应面分析
采用Design-Expert 8.0.5软件应用响应面分析法，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，结合前期单因素试验，以GABA含量为响应值，对单因素试验结果进行响应面试验，采用纸层析法测定发芽糙米中 CABA含量，研究工艺条件对提取效果的影响，确定最佳工艺路线。
1.2.4指标的测定
1.2.4.1 糙米发芽率的测定
将发芽后的糙米随机分成3份，从每一等份中取出2.0～3.0 g糙米，统计其中已发芽糙米数（糙米胚牙露出种皮达0.5～1.0 mm长即为发芽糙米）。发芽率=发芽糙米数／总糙米数×100%。
1.2.4.2 GABA的测定
1.2.4.2.1 纸层析法GABA标准曲线的绘制
将1mg/m L的GABA标准溶液稀释成浓度梯度0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/m L的溶液。将不同浓度梯度的标准溶液在滤纸上点样，展层，显色，以GABA浓度X与吸光度Y绘制标准曲线。
1.2.4.2.2 纸层析法GABA含量测定
1)点样：吸取5μL待测液，点样线距滤纸2.0cm，样品间距2.0 cm。将5μL样品分三次点，每点一次用电吹风吹于。注意每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm。
2)展层：将点好样的滤纸（点样面朝外）卷成简状，用透明胶带将滤纸两端粘住但两端能不接触。将滤纸直立于层析缸中（注意：点样端在下，展层剂的液面需低于点样线1 cm，滤纸勿与缸壁接触），盖好层析缸盖，进行展层。待溶剂上升15～20 cm时，取出滤纸，电吹风吹干。展开剂：V（正丁醇）：V（醋酸）：V（水）=4：1：3，0.4 g/d L茚三酮。
3)显色：滤纸在电吹风吹干后会显色，将与标准品位置一致的斑点剪下，用洗脱液洗脱，紫外分光光度计在520 nm处进行测定。洗脱剂：V（1 g/L硫酸铜）：V（体积分数75%乙醇）=2：38。
1.2.5数据分析
试验采用Origin 8.5软件制图，SPSS 19.0软件进行单因素显著性分析，Design-Expert 8.0.5软件应用响应面分析。
2结果与分析
2.1 浸泡时间对糙米发芽率和对GABA含量的影响
如图1所示，糙米的浸泡时间对糙米发芽率及其GABA提取量存在显著差异(p<0.05)。当糙米浸泡时间低于24 h时，随着浸泡时间的增加，糙米的发芽率和GABA提取率也随之增加，这可能是由于此阶段属于糙米吸水速度最快的物理吸涨过程，刚开始吸水时，随着吸水率的升高发芽率也会随之上升；而当浸泡时间大于24 h时，随着浸泡时间的增加，糙米
的发芽率和GABA的量却有所下降，这主要是因为浸泡时间过久将会导致糙米吸水饱和，并使其细胞结构严重受损，营养流失导致发芽率不高从而影响合成GABA。糙米的浸泡时间对GABA提取量的影响与在此条件下糙米发芽率趋势较为一致，即GABA提取量呈现先上升后下降的趋势，在浸泡24 h时，GABA提取率达到最大，为997.5 mg/kg，表明浸泡时间过长不利于发芽糙米生成GABA。因此，糙米最佳浸泡时间为24 h。
2.2浸泡温度对糙米发芽率和GABA的影响
如图2所示，当浸泡温度小于30℃时，随着浸泡温度的增加，糙米发芽率和GABA量也随之增加，因为温度越高，糙米的吸水率也越高，发芽情况越好；谷氨酸脱羧酶的活性也随温度升高而升高，产生的GABA也随之增加；当浸泡温度大于30℃时，随着温度的增加，糙米的发芽率明显下降，可能是因为糙米吸水饱和后，随着其胚芽的萌发，营养物质损失造成。也可能是由于温度过高，吸涨过快，吸水饱和后，细胞结构受到损害，营养物质传递不畅通所致。而GABA含量降低是因为随着温度的升高，糙米中谷氨酸脱羧酶的活性受到了抑制，产生的GABA也随之减少。糙米的浸泡温度对GABA提取量的影响与在此条件下糙米发芽率趋势较为一致，即GABA提取量呈现先上升后下降的趋势，在浸泡温度达到30℃时，
GABA提取率达到最大，为755.3 mg/kg，表明浸泡温度过高不利于发芽糙米生成GABA。因此，糙米最佳浸泡温度为30℃。
2.3发芽时间对糙米发芽率和GABA的影响
如图3所示，当发芽时间小于28 h时，随着发芽时间的增加，发芽率明显上升，这是因为糙米出芽时间主要集中在这段时间内；当发芽时间大于28 h时，糙米发芽率随着时间的增加几乎不变，GABA也缓慢下降是因为随着发芽时间的增加，是因为在发芽后期阶段，GABA会在转氨酶的作用下降解为琥珀酸半醛和丙酮酸，从而使GABA含量下降。而且随着发芽时间的延长，糙米芽过长，颜色偏黄，微生物大量繁殖，容易腐烂，产生严重的发酵味。糙米的发芽时间对GABA提取量的影响与在此条件下糙米发芽率趋势较不太相同，即发芽率随着发芽时间先上升后稳定而GABA提取量呈现先上升后下降的趋势，在发芽28 h时，GABA提取率达到最大，为897.6 mg/kg，表明发芽时间过长不利于发芽糙米生成GABA。因此，糙米最佳发芽时间为28 h。
2.4发芽温度对糙米发芽率和GABA的影响
如图4所示，当发芽温度小于30℃时，随着发芽温度的增加，发芽率和GABA含量明显增加，但温度低时，发芽缓慢，发芽周期加长；糙米中大量的内源酶被激活和释放，GABA等其他营养物质得以大量生成，但可以看出GABA量却不高；当发芽温度大于30℃时，随着发芽温度的增加，GABA含量随之小幅度降低，是因为温度过高抑制了谷氨酸脱羧酶的活
性，导致生成的GABA含量减少。糙米的浸泡温度对GABA提取量的影响与在此条件下糙米发芽率趋势较为一致，即GABA提取量呈现先上升后下降的趋势，在发芽温度为30 0C时，GABA提取率达到最大，为998.5 mg/kg，表明浸泡时间过长不利于发芽糙米生成GABA。因此，糙米最佳发芽温度为30 ℃。
2.5响应面分析法优化提取试验结果与分析
2.5.1 回归模型的建立及方差分析
通过单因素试验，得到了每个单因素的相对合适的条件，在此基础上对影响发芽糙米富集GABA的因素（浸泡温度、浸泡时间、发芽温度和发芽时间）进行四因素三水平的响应面试验。
对表1试验结果通过Design-Expert软件程序进行二次回归响应面分析。建立多立二次响应面回归模型，得二次多元回归模型为：Y=901.22-
对该模型进行方差分析( ANOVA)结果见表2。
由表可知回归决定系数R2=0.996 1，修正决定系数为0.992 3，说明该模型能解释0.992 3应值的变化，失拟项不显著(p>0.05)，因而该模型拟合程度良好，试验误差小，可以用此模型对糙米富集GABA试验进行分析和预测。通过宣接比较方程中一次项系数绝对值大小来判断因素影响的主次性，对糙米富集GABA的影响因素由大到小依次是：B（浸泡时间）>C（发芽温度）>D（发芽时间）>A（浸泡温度）。
2.5.2响应面分析法分析各因素间的相互作用结果
利用响应面分析浸泡温度、浸泡时间、发芽温度和发芽时间各因素之间的相互作用结果如图5所示。
浸泡时间和浸泡温度对糙米富集GABA都显出二次影响（图5a），随着二者的增加，GABA含量呈现先增加后减少的趋势，说明两者的交互作用对糙米富集GABA含量影响显著；从图中还可以看出浸泡时间的曲面坡度比浸泡温度的曲面坡度陡，说明浸泡时间对GABA含量的影响比浸泡温度对GABA含量的影响要大。浸泡温度与发芽温度对糙米富集GABA的影响较大，可以明显看出二者对GABA含量的影响具有二次效应（图5b），随着两者的增加，GABA的含量均呈现先增加后减少的趋势二者共同对CABA造成影响。
浸泡温度与发芽温度时间对GABA具有二次影响，随着二者的增加，GABA含量都先增加后减小（图5c），二者的交互作用对糙米富集GABA含量影响显著；且二者的曲面坡度十分明显，浸泡时间比发芽温度对GABA含量的影响更大。浸泡温度与发芽时间对GABA含量都有二次效应，随着二者的增加，GABA含量先增加后减小且曲面坡度近似（图5d）。随着浸泡时间与发芽时间的增加，GABA的含量都先增加，达到最高值后减少（图5e），说明二者对GABA含量都具有二次效应；从二者曲面坡度可以看出，浸泡时间对糙米富集GABA的影响大于发芽时间的影响。随着发芽温度与发芽时间的增加，明显看到GABA含量随之增加后再减小。从它们曲面坡度可以看出，发芽时间比发芽温度的坡度陡（图5f），说明发芽时间对糙米富集GABA的影响更大。
2.6最优条件的确定及验证
利用Design-Expert软件对模型进行进一步分析，以获得最优的提取条件。经分析得最佳的富集条件是：浸泡温度为29.72℃，浸泡时间为24.84 h，发芽温度29.67℃，发芽时间为27.94 h。考虑到操作的方便性，将提取工艺参数修正为浸泡温度为30℃，浸泡时间为24 h，发芽温度为30℃，发芽时间为28h。在此条件下糙米富集GABA含量可达到906.563mg/kg。重复三次试验，与理论值相差1%，响应面分析的的优化结果与实际值较吻合，具有一定的可行性。
3结论
试验结果表明：浸泡温度在30℃，浸泡时间24h，发芽温度30℃，发芽时间28 h时，糙米发芽率达到最优；浸泡温度29.72 ℃，浸泡时间24.84 h，发芽温度29.67℃，发芽时间27.94 h，发芽糙米富集GABA可达最佳。
考虑到实际操作可行性，将最佳条件修订为：浸泡温度为30℃，浸泡时间24 h，发芽温度30 h，发芽时间28 h。通过验证试验，表明实际测量值接近预测值，说明该模型是合理有效的具有一定的实际指导意义。
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