郑阳1 ，2，许秀丽1，杨丙成2，李绍辉1，张元1，张峰1*
1．中国检验检疫科学研究院食品安全研究所(北京100123)；2．华东理工大学药学院(上海200237)
摘要香豆素作为一种常见的食品添加剂，长期服用或接触将会引起过敏、肠胃不适等不良反应，危害人类健康，因此检测香豆素类化合物用量具有重要的意义。阐述了香豆素的研究背景和现状，就近些年来国内外食品中香豆素类化合物的前处理方法及检测方法的研究现状进行了综述，并比较了不同前处理方法的优缺点，旨在为食品中香豆素类化合物的监控提供参考。
关键词 香豆素；危害；食品；分析方法
香豆素，又名苯并a-吡喃酮，其母体为苯环与氧杂环并合成的双环化合物。香豆素类物质主要存在于芸香科、伞形科和菊科等高等植物中，在动物及微生物代谢产物中也有存在。根据其结构可分为简单香豆素类（如6-甲基香豆素）、呋喃香豆素类（如补骨脂素）、吡喃香豆素类（如花椒内酯）和其它香豆素类（如蛇床子素）等。由于香豆素有定香与提升香气的作用，作为香味添加剂广泛地应用于食品中。
早在1900年以前，国外文献已有关于香豆素毒性问题的报道。香豆素主要会致动物的长期昏迷或死亡，常见的症状是肝退化与坏死、血管变化与海绵状血管瘤等。随着科技手段的不断进步，人们对香豆素毒性的研究日益深入。经研究表明，香豆素类物质的毒性来自于其母体的化学结构，见图1。母体中氧原子由于耦合双键的作用而具有较强的活动性，容易在体内引发产生氧自由基，破坏机体，对肝肾产生中等毒性，从而危害人类健康。
许多国家地区及相关机构对食品中香豆素含量进行了规定，具体见表1。
基于国际上对香豆素类化合物毒副问题的日益关注，建立准确快速简便的香豆素分析检测方法对于评估食品安全性有着重要作用。就近年来国内外文献报道的食品中香豆素类物质前处理及检测方法进行了简要的总结。
1 香豆素类化合物前处理方法
建立复杂基质中香豆素的检测方法，前处理是非常重要的一个环节。前处理不仅要最大限度地提取目标物，还要最大程度减少杂质的量，降低基质干扰。目前针对食品中香豆素物质的前处理方法有传统方法例如液液萃取( Liquid-liquid extraction, LLE) 、新型前处理技术(如分散液一液微萃取( Dispersiveliquid-liquid microextraction, DLLME))、固相萃取( Solid-phase extraction, SPE)、超临界流体萃取( Supercritical fluid extraction, SFE)、基质分散固相萃取( Matrix solid-phase dispersion, MSPD)和加压溶剂萃取( Pressurized liquid extraction, PLE)等。
各种前处理方法优缺点见表2。
1.1液-液萃取
液-液萃取( LLE)是目前应用较多的前处理方法，该方法采用甲醇等有机溶剂或甲醇一水等混合溶剂进行提取，离心后过膜即可上机检测。
陈捷等采用无水乙醚萃取含油脂的固体样品、不含油脂的固体样品和饮料酒类等液体中的香豆素，此方法萃取效果较好，但乙醚所需量较大，样品处理稍显繁琐。
分散液一液微萃取( DLLME)是在液-液萃取基础上发展起来的一种新型样品前处理技术。该方法首先在样品溶液中加入数十微升的萃取剂和一定体积的分散剂，混合液经轻轻振荡后形成一个水／分散剂／萃取剂的乳浊液体系，再经离心分层，用微量进样器取出萃取剂直接进样分析。
朱晓兰等建立了烟用添加剂中香豆素等8种有害物的DLLME提取、净化方法，并对液-液分散微萃取溶剂及其体积、分散剂及其体积和萃取时间等条件进行了优化，最终选择70 μL氯仿作为萃取剂，0.5mL甲醇作为分散剂，萃取时间为3 min。富集倍数为140～208倍，该方法的加标回收率为90%～l00%，与行业推荐的测定方法相比，该方法具有富集效果好、回收率高等优点。
1.2固相萃取
固相萃取( SPE)是近年发展起来一种样品预处理技术，由液-固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和浓缩。
韩超等考察了3个SPE柱(Superclean ENVI C18、Waters Oasis HLB和Waters Oasis MAX)对奶粉样品的净化效果，并比较了各固相萃取吸附剂的萃取效率。结果发现，Waters Oasis HLB SPE柱的净化处理效果较好，其加标回收率为85.2%~107.4%，基本满足要求。具体操作：用5 m L甲醇和水平衡活化固定相，以甲醇-水(1:9，V/V)作为淋洗液，随后采用6 m L甲醇作为洗脱液，将4种香料洗脱完全，其中香豆素的定量限为5.0μg/kg，口]应用于婴幼儿奶粉中香料检测。
固相微萃取( Solid-phase microextraction，SPME)是在固相萃取基础发展的一种处理技术，其关键在于选择石英纤维上的涂层（吸附剂），要使目标化合物能吸附在涂层上，而干扰物与溶剂不吸附，一般目标化合物是非极性即选用非极性涂层，极性时选择极性涂层。
据了解，目前并未有利用SPME测定食品中香豆素的文献报道，多数报道为利用SPME测定其他香味成分。Clark等在运用SPME分析烟草中增香剂时，对四种不同规格及材料（100μm甲基硅胶、65μm聚丙烯酸酯、65I_Lm甲基硅胶／二乙烯基苯及65μm聚乙二醇／二乙烯基苯）的萃取头进行了考察，试验结果表明，65 μm聚乙二醇／二乙烯基苯萃取头对烟草中香气物质的萃取效果最好，这是由于其具有中等极性，对极性和非极性物质都有较好的吸附效果。
1.3基质固相分散萃取
基质固相分散萃取( MSPD)原理是将涂有C18等多种聚合物的固相萃取材料与样品一起研磨，得到半干状态的混合物并将其填料装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将待测物淋洗下来。
Anna等将基质固相分散萃取技术应用于分析独活中呋喃香豆素成分的检测中来，并对MSPD条件进行了优化。具体操作步骤：0.25 g样品与0.5 g C18分散剂混合，用不同的溶剂（石油醚、二氯甲烷等）萃取，其中80%甲醇和石油醚／甲醇（50：50，V:V）对香豆素的提取效果最好，基质分散固相萃取柱经5 m L 80%甲醇洗脱后，提取物进HPLC进行分析。
1.4加压溶剂萃取(PLE)
加压溶剂萃取是在较高温度( 50℃～200℃)和压力(1 000～3 000 psi)下用有机溶剂萃取固体或半固体的自动化方法。
Vierikova等采用了加压溶剂萃取技术，以二氯甲烷为萃取剂，萃取液使用凝胶渗透色谱净化，测定各种食品中香豆素残留的方法，该方法的检出限和定量限分别为20 μg/kg和50μ g/kg，满足试验要求。
1.5超临界流体萃取
超临界流体萃取( SFE)是在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地依次把极性大小、沸点高低和相对分子质量大小不同的成分萃取出来。
Eila等建立了芹菜中光毒性呋喃香豆素类化合物的分析方法。该方法优化了SFE条件，在20 M Pa、80℃、CO2密度0.587 g/m L下提取效率最高，回收率均在90%以上。该方法同样适用于其他蔬菜中呋喃香豆素的测定。
2香豆素类化合物检测技术
2.1高效液相色谱法(HPLC)
在香豆素类物质的检测中，高效液相色谱应用最为广泛，常配以二极管阵列检测器( DAD)或紫外检测器(UV)，选择合适的色谱柱、流动相及检测波长，是实现分离的关键因素。目前在检测香豆素时广泛使用的是反相C18柱。
流动相一般选择甲醇、乙腈、水和冰醋酸等，针对不同的物质选择不同配比的流动相。席海为等建立了一种同时测试都梁滴丸中5-甲基补骨脂素、欧前胡素和异欧前胡素含量的HPLC-UV方法。三种物质的检测波长依次为320，254和254 nm。三种物质的RSD分别为2.89%，0.31%和2.45%，适用于药品的检验工作。
2.2液相色谱质谱法(HPLC-MS)
在单纯高效液相色谱的基础上发展起来的液质联用技术，被认为是目前效果最好的分析手段，质谱由于灵敏度和选择性高于其他检测器，因而可以分析更多的物质，在使用此法的研究报告中，香豆素都是作为复杂混合物的一个或几个组分被检出的。但需要注意的是，液相色谱与质谱的接口不容易实现顺利对接，必须经过适当的溶剂挥发过程，这在一定程度上限制了可分析物质的种类。
Ahn等建立了同时测定朝鲜当归根中9种香豆素成分的HPLC-DAD/MS方法。该方法比较了不同色谱柱对9种香豆素分离能力的大小，试验结果证明Capcell Pak C18 UG 120( 250 mm×4.5 mm,5μm)分离效果最好，9种香豆素在0.2～250 μg/m L表现出良好
的线性关系，R2在0.998～0.999之间。该方法重点研究了朝鲜当归中香豆素化合物的特征，可用以朝鲜当归的质量控制，并区分不同产地。
Raters等报道了了LC-MS/MS测定混合调味料、肉桂饼干等在内的500种食品中香豆素的检测方法。该方法使用d4-香豆素作为内标物定量，检出限和定量限分别为0.03 mg/kg和0.05 mg/kg，选择性和灵敏度比HPLC-UV法高出100倍。
2.3 气相色谱质谱法(GC-MS)
气相色谱是一种对易于挥发而不发生分解的化合物进行分离与分析的色谱技术，主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。香豆素物质具有挥发性，能够在气相条件下实现分离。
李长于等采用GC-MS/MS测定香精香料中香豆素含量，以丙酸苯乙酯为内标进行定量，检出限为40μg/kg。MS/MS排除干扰能力强，定量是本底值低，适用于香精香料或其他食品添加剂等辅助样品中香豆素快速检测。
吴惠勤等用GC-MS测定了烟用香精中香豆素含量。该方法使用DB-1MS色谱柱，用色谱保留时间、质谱特征离子同时定性，消除了香精样品中复杂基体的干扰，避免了假阳性结果的出现。检出限为0.1 mg/kg，能够满足烟用香精中香豆素物质的检测。
2.4 毛细管电泳法(Capillary electrophoresis，CE)
毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。目前该技术在分析香豆素物质的应用较少，但已报道的方法均能很好地满足定量要求，是一种具有潜力的检测方法。
邱涵等采用毛细管电泳法测定了克炎肿片中香豆素的含量。电泳缓冲液为25 m mol/L的硼砂-硼酸液（pH为9.2），内含30 m mol/L的十二烷基磺酸钠和10%乙腈，运行电压为20 kV，检测波长为214 nm。其中香豆素的线性范围为25～125μg/m L，RSD为2.0%。可满足试验要求。
3结语
目前针对香豆素类化合物的前处理方法多是液一液萃取，而一些新兴的前处理方法不仅能够提高分析选择性和灵敏度，还可以减少对环境和人体的危害，但由于某些设备价格较为昂贵，运行和维护成本较高，因此降低成本是该方法是否能够普及的关键。检测方法以HPLC-MS、GC-MS为主，这是由于该方法能够更好地满足定性定量要求。虽然香豆素类成分在某些行业已被禁用，但经调查发现，香豆素在食品行业应用仍十分广泛，这在一定程度上对人类健康存在潜在的威胁，因此建立香豆素类化合物的分析方法对于产品质量控制及应对国内外不断变化的产品质量法规有着十分重要的意义。
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