人自噬相关蛋白ATG5的原核表达及纯化

晋帅1，洪甜2，闫志风1，马永富1，褚健1,2，易绍琼1，徐小洁2，叶棋浓2，刘阳1

1．解放军总医院，北京100853；2．军事医学科学院生物工程研究所，北京100850

[摘要]  目的：原核表达纯化带His标签的自噬相关蛋白ATG5。方法：利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人ATC5基因的编码序列，插入载体pET-28a(+)中得到重组质粒，经BamH I和Xho I双酶切鉴定后转化大肠杆菌Ros-sate进行小量诱导，挑选出可以诱导His-ATG5蛋白的菌液进行融合蛋白的纯化，通过Western印迹和SDS-PACE检测融合蛋白的纯化效果：结果：用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约828 hp的目的片段，插入载体pET-28a(+)构建出His- ATG5重组质粒并经酶切及测序验证；转化大肠杆菌Rossate后进行小量诱导表达并纯化蛋白，SDS-PAGE检测显示获得相对分子质量约为38xl03的融合蛋白。结论：原核表达并纯化获得His-ATG5融合蛋白，为后续研究ATG5在自噬中的作用机制奠定了实验基础。

[关键词]  人自噬相关蛋白ATG5；原核表达；纯化；自噬

[中图分类号] Q78  [文章编号]  1009-0002( 2016) 02-0196-04

 自噬相关基因5 (autophagy related gene 5，ATG5)是参与自噬的重要基因。研究发现，细胞自噬体的形成离不开2个必需系统的参与：第一个是针对2种自噬蛋白ATG12与ATG5结合形成LC3前体的调节系统，此阶段需要El样酶ATG7和E2样酶ATG10共同参与活化；另一个是针对自噬体LC3蛋白的脂化系统…，它们都属于泛素样蛋白结合系统。由于ATG5在自噬体形成前期与保守蛋白ATG12结合，参与形成了自噬体形成过程中所必需的自噬共轭连接体ATG12-ATG5，因此，ATG5在自噬过程中起到了重要的调控作用。

 多细胞生物的白噬机制是一个多步骤调节的过程，信号传导非常复杂，目前尚未完全明了。鉴于人ATC5基因在细胞自噬中的重要作用，我们基于本研究机构以往的研究基础，构建了人ATC5基因的原核表达质粒，表达并纯化得到含His标签的ATG5融合蛋白，为进一步研究细胞自噬的作用及机制奠定了实验学基础。

1材料和方法

1.1材料

 大肠杆菌Rossate感受态及DH5a感受态、原核表达载体pET-28a(+)由本实验室保存；限制性核酸内切酶、PCR所需试剂及T4DNA连接酶由TaKaRa公司提供；合成ATG5基因片段的上、下游引物由作者设计，北京赛百盛生物技术有限公司合成；DNA胶回收试剂盒购自北京天根生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、His-Sepharose 3珠子由Pharmacia公司提供；带有HRP标签的鼠二抗及带有His标签的鼠单克隆抗体由Sigma公司提供；已构建的基因测

序南北京华大生物技术有限责任公司完成。

1.2人ATG5基因编码区的扩增

人ATG5基因的扩增引物是根据4TG5基因编码

为人乳腺文库，扩增过程中使用Pfu酶。PCR条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸90 s，30个循环；72℃再延长7 min。PCR结束后检测PCR产物，在紫外灯下鉴定后，切出目的基因片段，利用DNA胶回收试剂盒完整回收目的基因片段。

1.3  His-ATG5重组质粒的构建及鉴定

 目的基因PCR产物及载体pET-28a(+)均经限制性内切酶BamH I、Xho I双酶切后，用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜后转化大肠杆菌DH5a，挑出单克隆活化菌落，37℃培养12 h后提取质粒，经BamH I和Xho I双酶切鉴定正确后，送北京华大生物公司进行测序。

1.4重组质粒His-ATG5的小量诱导表达

 将测序结果正确的重组质粒转入大肠杆菌Ros-sate菌株，挑选单克隆活化成功的菌落到10 m L含卡那霉素( Kan)的LB液体培养基中，37℃振荡培养约90 min，当培养液D600nm，值约为0.6时加入10 μL诱导剂IPTG（终浓度为1m mol/L）进行小量诱导，条件为37℃振荡培养4～6 h。诱导前后各取500 μL菌液，同时诱导前用50%甘油保存菌种（甘油与菌液的比例为1:1）。诱导前后的菌液于12 000 r/min离心2 min，弃上清后加等量的SDS，用SDS-PAGE和Western印迹检测诱导效果。

1.5  His-ATG5融合蛋白的纯化

 将小量诱导的His-ATG5阳性Rossate菌液（已保的菌种）200μL接种于10 m L LB液体培养基(含Kan)中，37℃振荡培养至D600nm值约为3.0，转接至200 m L含Kan性的LB液体培养基中，30℃振荡培养至D600nm值为0.4～0.6，加20 μL IPTG(终浓度为0.1m mol/L)后改为低温(20℃)诱导培养24 h以上，进行融合蛋白的纯化。

 将菌液于4℃、10 000 r/min离心10min，弃上清，加入配置正确的蛋白纯化裂解液重悬菌体，确保菌体完全重悬后冰浴30 min，将重悬好的菌体放在冰上进行超声波裂解，单次超声时长10 s（超声5s．间歇Ss），总时长10 min，完毕后于4℃、10 000 r／min离心10 min，收集上清，加入200μL His-Sep-harose 3珠子，4℃旋转结合4 h，4℃、3000 r/min离心10 min，收集纯化珠子，缓冲液洗脱后得到纯化的融合蛋白。用Western印迹对纯化蛋白进行鉴定。

2结果

2.1人ATG5基因编码序列的克隆、

 扩增模板为人乳腺文库，扩增过程使用Pfu酶，获得与预期片段大小（约828 b p）一致的PCR产物（图1）。

2.2重组质粒His-ATG5的构建及鉴定

 用BamH I和Xho I同时对目的基因片段及pET-28a(+)载体进行双酶切，之后将二者连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经菌液PCR后挑选阳性克隆（图2），提取相应的质粒，对质粒进行BamH I和Xho I双酶切鉴定，可见约828 b p的目的基因条带和对照pET-28a(+)孔载体条带（图3），表明人ATC5基因的编码序列已插入载体pET-28a(+)相应的酶切位点中。将连接成功的质粒送北京博迈得生物技术有限责任公司测序，测序后的目的片段与文献报道的相应序列进行比对，结果表明两者完全一致（序列略），无任何突变现象发生。

2.3  重组质粒His-ATG5的小量诱导表达

 将重组的pET-28a(+)-ATG5质粒转化大肠杆菌Rossate菌株，选取单克隆菌落，经活化、加IPTG诱导4～6 h后，对诱导前后的菌液行SDS-PAGE和Western印迹检测，结果表明His-ATG5重组质粒表达正确（图4）。

2.4  融合蛋白His-ATG5的纯化

 用His-Sepharose 3亲和珠对His-ATG5融合蛋白进行纯化，考马斯亮蓝染色结果提示His-ATG5融合蛋白纯化成功（图5）。

3讨论

 自噬是真核生物所特有的生命现象，是细胞通过溶酶体来降解细胞内受损的细胞器及大分子物质，并以此来保持细胞代谢的平衡和细胞内环境的稳定，这一过程可以促进细胞生长、增殖。自噬的整个过程受自噬相关基因的调控。细胞自噬既能在细胞应对不良环境刺激时作为一种防御机制实现自我保护，同时在肿瘤、神经退行性疾病、病原体感染、衰老等多种疾病的发生过程中起到重要作用，表现为双重作用。近年来相关研究发现自噬与肿瘤密切关联，针对二者关系的研究已经引起肿瘤学科的广泛关注。

 细胞自噬大致分为3个阶段：第一阶段为起始阶段（细胞接受刺激信号），第二阶段为自噬体形成（ATG12-ATG5和ATG8-PE复合体2种泛素样结合系统），第三阶段为白噬溶酶体的形成及内容物的降解而白噬体膜脱落再循环利用。ATG5在第二阶段与高度保守的ATG12结合，形成ATG12-ATG5共轭连接体，调控着自噬体的形成，在细胞自噬中发挥着极为重要的作用。

 His-tag是由6个组氨酸组成的短肽，近年来多被用于重组蛋白的纯化吸附。本实验选择His-tag融合标签纯化ATG5的原因是17①His-tag标签蛋白小，在蛋白过表达的过程中可以有效降低能量消耗；②His- tag标签蛋白结合能力高；③纯化过程价格合理。为得到较好的融合蛋白，我们也参考了文献报道的经验，如纯化过程中采用低温( 200C)诱导、降低IPTG的终浓度等多种方法，以减少非特异蛋白条带。

 综上所述，我们构建了带有His标签的ATG5重组质粒，经原核表达后纯化得到His-ATG5融合蛋白，为后续研究细胞自噬体外蛋白的作用机制奠定了实验基础。