夏桑菊凉茶中多成分含量测定方法的研究

 孙鹏1，2，李贵节1，2，朱凯1，王睿1， 2*

1．重庆第二师范学院生物与化学工程系（重庆400067）；2．重庆第二师范学院功能性生态食品研究所(重庆400067)

摘要研究了高效液相色谱法(HPLC法)检测夏桑菊凉荼中绿原酸、迷迭香酸、木犀草苷、芦丁、槲皮素和蒙花苷含量的方法。色谱条件为：依利特C．。色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，甲醇-0.1%乙酸钠水溶液(乙酸调至pH 3.0)梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长350mn，柱温40℃。结果表明：6种活性成分的分离度良好，线性范围分 别0.03～100，0.04～3.125，0.04～124，0.06～2.88，0.01～28和0.37～19 μg/m L，检测限分别为0.19，0.26，0.24，0.38，0.078和2.2μg/g，定量限分别为0.62，0.88，0.80，1.24，0.26和7.4μg/g，平均回收率在99.4%~101.5%之间，精密度RSD分别为0.25%， 0．18%，0.49%0，0.84%，0.92%0和2.30%。该方法专属性强，精密度好，可用于夏桑菊凉茶中绿原酸、迷迭香酸、木犀草苷、芦丁、槲皮素和蒙花苷等物质的定量测定，并可应用于夏桑菊凉茶产品的质量控制。

  关键词  HPLC;夏桑菊；凉茶；含量

 “夏桑菊”源自清代著名温病学家吴鞠通《温病条辨》的经典名方“桑菊饮，主要由夏枯草、桑叶和菊花配伍而成，具有清肝明目、疏风散热、除湿痹和解疮毒等功效，用于风热感冒、目赤头痛、头晕耳鸣、咽喉肿痛和疔疮肿毒等症，并可作清凉饮料使用。

 近几年，凉茶饮料在市场上热销，越来越多的企业开始关注这个新兴的饮料市场，凉茶新产品不断出现在市场上。  “夏桑菊”作为传统名方，2006年开始出现在饮料市场上，截至目前已有多家企业生产“夏桑菊”凉茶饮料。据调查，2013年全国凉茶总销售额超过300亿元，占国内饮料市场份额的20%以上。然而，与凉茶饮料的热销形成鲜明对比的，则

是目前我国对于凉茶类饮料的国家标准还不够完善，仅有一些地方标准或企业标准。这些标准虽然对凉茶中添加的中药材种类有所规定，但对其含量以及功效却甚少涉及。

 夏枯草是夏桑菊中的君药，主要活性成分有迷迭香酸、木犀草苷、芦丁和槲皮素等，《中国药典》中以迷迭香酸为夏枯草的指标性成分。桑叶中的主要活性成分有绿原酸、芦丁和槲皮素等，《中国药典》中将芦丁作为桑叶的指标性成分。菊花中的主要活性成分有绿原酸、木犀草苷和蒙花苷等，《中国药典》中绿原酸和木犀草苷为菊花的指标性成分。试验收集到了市场销售的8种夏桑菊凉茶饮料，结合《中国药典》对夏枯草、桑叶和菊花的指标性成分要求，以及上述3种药材活性成分的文献报道，对夏桑菊凉茶中的绿原酸、迷迭香酸、木犀草苷、芦丁、槲皮素和蒙花苷6种活性成分进行了定量分析，以期为夏桑菊凉茶的质量控制提供有价值的参考。

1  仪器、设备与试剂

 Agilent 1260高效液相色谱仪（四元梯度泵，紫外检测器，Open LAB色谱工作站）：美国Agilent公司；FA2004分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DZF6050真空干燥箱：苏州江东精密仪器有限公司；RE-5286台式离心机：上海安亭科学仪器厂；KQ5200超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

 绿原酸、迷迭香酸、木犀草苷、芦丁、槲皮素、蒙花苷对照品：上海金穗生物科技有限公司；甲醇（色谱纯）：美国Honeywell公司；乙酸钠、乙酸等均为分析纯：重庆博艺化学试剂有限公司；水为自制重蒸水。

 夏桑菊凉茶样品：市售，产自重庆、四川、广东和广西等地。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备

 称取在25℃减压干燥12 h的绿原酸、迷迭香酸、木犀草苷、芦丁和槲皮素对照品5 mg，精确至0.01mg，置于50 m L容量瓶中，加甲醇适量，振摇使其溶解，继续用甲醇稀释至刻度；蒙花苷对照品5 mg，精密称定，置100 m L容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容。用上述方法制得对照品储备液，将储备液置于4℃避光保存。

 精密量取绿原酸、迷迭香酸、木犀草苷、芦丁和槲皮素对照品储备液各1mL，蒙花苷对照品储备液2mL，置10 m L容量瓶中，加甲醇定容，即得混合对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备

 收集市售的8种夏桑菊凉茶，分别编号为A，B，C，D，E，F，G和H。其中A~G为固体饮料（颗粒剂），H为液体预包装饮料。

 固体样品处理：称取样品2.5 g，精确至0.1 mg，置容量瓶中，加入质量分数50%甲醇水溶液50 m L，称定质量，室温下超声30 min(功率250 W，频率40kHz)，取出，静置至室温，补足质量，摇匀，4 000r/min离心5 min，倒出上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

 液体样品处理：取样品适量，4 000 r/min离心5mm，倒出上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3  色谱条件与系统适用性试验

 色谱柱：依利特C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流速：1 m L/min；进样量：20 VL；柱温40℃；采集时间35 min；流动相：A为甲醇，B为0.1%乙酸钠水溶液（乙酸调至pH 3.0）；通过比较330，340，350和360 nm等多个检测波长，发现在350 nm波长条件下6种成分的吸光度均比较理想，因此将350nm选作检测波长。梯度洗脱条件见表1；

  在该色谱条件下，混合对照品和样品的色谱图见图1。

  该色谱条件下，对称因子、塔板数和分离度等系统适用性试验结果见表2。

2.4检测限和定量限

 将一系列已知浓度的对照品进行分析，通过考察图谱在一段时间（图谱中平坦的时间段）的噪音，分别以信噪比RSN=3和RSN=10时各对照品的量作为检测限和定量限。上述检测限和定量限乘以方法稀释倍数除以样品称样量，得该方法的检测限和定量限见表3。

2.5线性范围

 精密量取由2.1方法制备的对照品储备液适量，用甲醇稀释成系列浓度，以2.3的方法进行试验，并记录峰面积。以对照品质量浓度X（μg/m L）为横坐标，峰面积y为纵坐标进行线性回归分析，线性范围、回归方程以及相关系数见表4。

2.6精密度试验

 取由2.1方法制备的混合对照品溶液，照2.3项下色谱条件，样品平行测定6次，所得绿原酸、迷迭香酸、木犀草苷、芦丁、槲皮素和蒙花苷峰面积的RSD分别为0.25%，0.18%，0.49%，0.84%，0.92%和2.3%。结果表明该方法精密度良好。

2.7加样回收试验

 精密量取2.2项下已知含量的夏桑菊凉茶样品10mL共9份，分3组，分别精密添加2.1项下混合对照品溶液4，5和6 m L，加甲醇稀释至20 m L，照2.3项下色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，计算回收率。结果如表5所示，表明该检测方法具有良好的回收率。

2.8样品测定

 每种样品各取3份，以2.2的方法制备供试品溶液，照2.3项下色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，并计算样品中的绿原酸、迷迭香酸、木犀草苷、芦丁、槲皮素和蒙花苷含量。为方便比较，所有的含量均折算为每份最小包装样品（A~G最小包装均为10g，H最小包装为350 m L）中所含的成分质量，试验结果见表6。

3结论与讨论

 在研究文献报道和已有的国家标准基础上，选取了具有代表性的6种成分作为夏桑菊凉茶多组分质量控制的指标性成分。通过试验研究发现，收集到的产自重庆、四川、广东和广西等地的8种市售夏桑菊凉茶饮料中绿原酸、迷迭香酸、木犀草苷、芦丁、槲皮素和蒙花苷6种成分的含量相差较大。由于绿原酸是3种药材的共有成分，因此在7种样品中均有检测出，其中样品C检测出的绿原酸含量低于定量限，样品D仅检测出绿原酸一种成分；除了样品H有槲皮素检出外，其余样品均未检测到该成分；而样品E则未检出上述6种成分。由此可见，不同企业所生产的夏桑菊凉茶饮料，其产品配方存在着较大差异。

 凉茶在现行国家标准中属植物饮料类中的其他植物饮料，即以符合国家相关规定的其他植物原料经加工或发酵制成的饮料。目前，没有专门针对凉茶的国家标准或行业标准。广东省地方标准《植物饮料（含凉茶）》（征求意见稿）规定凉茶中添加的中药材原料应符合《中国药典》、《部颁药材标准》和《广东省中药材标准》的要求，但对于凉茶饮料中活性成分的含量仍然没有做出定量要求，截至定稿时，该标准仍未正式执行。而在2008年发布的茶饮料国家标准，对各种茶饮料主要活性成分（茶多酚、咖啡因）的含量做出了明确规定，这在一定程度上确保了原料用茶的比例，保证了茶饮料的产品质量。凉茶类饮料标准的欠缺，使得这一类产品的质量无法得到有效控制，整个行业面临无序发展的风险。

 目前，对于上述6种成分的定量分析，往往需要采取不同的样品前处理方法和流动相体系。而在预试验的基础上，简化了样品前处理过程，对6种待测成分采用梯度洗脱方式，使这些成分在同一色谱条件下能够有效分离，理论塔板数和分离度均比较理想。该方法操作简便，避免了多波长检测操作繁琐等难题，精密度、重复性和回收率均达到定量分析要求，为夏桑菊凉茶饮料的产品质量控制提供了可借鉴的试验方法，具有一定的参考价值。