桑椹花色苷分离及结构鉴定研究进展

 马义虔1，彭黔荣2，冯贵涛1，乔爽3，李影3，杨敏3*

  1．贵州大学化学与化工学院(贵阳550025)；2．贵州中烟工业有限责任公司技术中心（贵阳550009）；3．贵州大学药学院（贵阳550025）

摘要桑椹花色苷是2-苯基苯并吡喃结构多羟基和多甲氧基衍生物的一类水溶性糖苷，具有抗氧化、抗癌、抗肥胖和神经保护等生物活性，可广泛应用于食品、药品及化妆品行业。桑椹花色苷的抗氧化活性与其结构和含量密切相关。对桑椹中花色苷分离及结构鉴定的研究具有十分重要的意义。综述近十年来国内外桑椹花色苷分离及结构鉴定的研究。

关键词  桑椹；花色苷；分离；结构鉴定

 桑椹( Mulberry fruit)是桑科桑属植物的成熟聚花果。大多数种植桑椹的国家，有3个品种的桑椹：红桑（Morus rubra），黑桑（Morus nigra）和白桑（Morus alba）。桑椹富含多种对人体有益的成分，  如：花色苷、有机酸、糖类、酚类、维生素和微量元素等。在民间医学上，桑椹用于滋阴补血、生津润燥、肝肾阴虚、眩晕耳鸣、心悸失眠、须发早白、津伤口渴、内热消渴和肠燥便秘等。此外，桑椹中花色苷具有多种生物活性，如：抗血栓、抗氧 比、抗菌、抗癌、抗炎、神经保护和抗肥胖作用。但桑椹最重要的医药价值是抗氧化作用。

 桑椹花色苷（Anthocyanins）是2-苯基苯并吡喃(2-Phenylbenzopyrilium)结构的一类糖苷衍生物，为植物界广泛分布的一种水溶性色素。研究表明：花色苷的抗氧化活性随着羟基数目的增加、糖基化程度的减少而增强；花色苷B环上有邻羟基的比没有邻羟基的抗氧化活性强；B环羟基若被甲氧基取代，其抗氧化活性也相应下降。Kahkonen等用人类低密度脂蛋白为模型，研究发现花色苷元的抗氧化活性为：D p=Cy>M v>P n>P g>P t（缩写对应的中文名见图1），而花色苷的抗氧化活性弱于其花色苷元。

 目前，国内关于桑椹花色苷的文献综述主要侧重于提取、纯化，稳定性和药理作用方面。就近十年来国内外桑椹花色苷分离及结构鉴定进行综述，以期为桑椹花色苷的鉴定、抗氧化活性研究和进一步开发利用提供参考。

1  紫外一可见光谱法

 1958年，Harborne将紫外一可见光谱法应用于花色苷结构的初步鉴定，如：(1)花色苷在500～550nm和275 nm左右有2个最大吸收峰，则可判断被检测物质是否为花色苷；  (2)相比HCl-CH3OH体系而言，花色苷在HCl-CH3CH2OH体系中红移10 nm左右，HCl-H2O体系中蓝移15 nm左右，亦可判断为花色苷；(3)向花色苷的0.01%盐酸-甲醇溶液中加入3～5滴

5% AICl3-CH3OH溶液，若出现Amax红移，说明B环有邻位羟基；  (4)加入3～5滴CH3ONa，若红移且吸光度不随时间减少，表明C4'位上有羟基，且C3位羟基形成糖苷；(5)根据A440/Aλmax比值，判断分子内酰基的个数和糖苷的位置；(6)根据花色苷在300～330 nm有无吸收峰，若有吸收峰，表明有酰基存在；(7)根据花色苷在440 nm处是否有肩峰，若有肩峰，说明C5位的羟基未被取代。

 胡金奎研究发现，样品溶于0.01% HCI-CH3OH溶液后在528 nm处有最大吸收峰，则可判定为花色苷；向样品溶液中滴加3～5滴AICl3后，527 nm处吸收峰发生红移，说明桑椹花色苷B环含有邻位酚羟基；加入CH3ONa后，样品在527 nm处吸收峰发生明显的红移，说明桑椹花色苷C3位被糖苷取代。该方法能初步鉴定花色苷结构，但是在使用过程中应注明使用的溶剂体系。

2高效液相色谱

 HPLC是分离和鉴定酚类物质（花色苷，黄烷醇和异黄酮等）最常用的分析技术，通常选用反相色谱柱以及乙腈／甲醇-甲酸／乙酸-水为流动相进行酚类物质的分离。Kamiloglu等通过HPLC-PDA分离检测土耳其黑桑产品中新鲜桑椹得到4个峰，经4种标品的色谱图对比可知：C3G是主要的花色苷，其中还含有C3R、P3G（天竺葵素-3-葡萄糖苷）和P3R（天竺葵素-3-芸香糖苷）；黑桑产品中除桑椹果汁和桑椹糖浆外，其余6个产品的C3G含量达53.93%以上，且桑椹中总黄酮和酚类含量与抗氧化活性呈正相关性。

3高效液相色谱-电喷雾质谱技术

 HPLC-MS结合了HPLC的强分离能力与MS的强鉴定能力，从而可得到化合物的保留时间、分子量及特征结构碎片等丰富的信息，具有分析结果准确、检出限低的特点，广泛用于结构复杂花色苷的鉴定与分析。Steranut等采用Dionex C18 AcclaimR120

色谱柱( 150 mm×4.6 mm，5μm)、甲醇-三氟乙酸-水为流动相分离罗马尼亚黑桑椹中花色苷得到3个峰，经标品色谱图的对比及MS数据可推测出3个峰为C3G、C3R和P3G，其中C3G和C3R分别为总花色苷含量的64.13%～78.23%和20.24%～35.21%。Eng m ann等使用超高压( HHP)设备在200，400和600 M Pa下处理江苏桑椹花色苷后，采用HPLC-DAD-ESI/MS技术鉴定得到4种花色苷，其中天竺葵素-3-（香豆酰）葡萄糖苷( P13Co)和飞燕草素-3-（香豆酰）葡萄糖苷( Dp3Co)是首次被发现的酰化花色苷。Zhang等采用HPLC-DAD-ESI-MS/MS技术分析云南蒙自县2个白桑品种（大十和红果）果渣得到5种花色苷，分别为：C3G、C3R、P3G、P3R和Cy-3-sop（矢车菊素-3-槐糖苷），这与2001年Dugo等报道的相似。其中C3G和C3R为总花色苷含量的98%，经Sephadex LH-20分离及AB-8树脂纯化后纯度能达到98%以上，可被用作食品着色剂和强抗氧化剂。Yang小组使用乙醇／硫酸铵为双水相体系，经提取、分离江苏桑椹（Morus atropurpurea Roxb）花色苷后，采用HPLC-PDA-ESI/MS/MS技术检测得到5种花色苷，其中飞燕草素-3-芸香糖苷、飞燕草素-3-（丙二酰）葡萄糖苷和芍药素-3-木糖鼠李糖苷首次被报道。该小组使用双水相萃取( ATPE)是依据物质在两相间的选择性

分配进行液-液萃取，除糖率达90%以上，且ATPE提取物的抗氧化活性强于传统法的提取物，当提取物质量浓度为300 g/μm L时，ATPE提取物的DPPH清除能力达91.5%，高于传统法提取物(74.0%)。相比传统法而言，ATPE不会影响花色苷的成分，并能使花色苷保持较高的抗氧化活性。邹堂斌采用HPLC-ESI/MS测定广州越秀区桑葚（Morus atropuipurea Roxb）中

花色苷的种类，得到8种花色苷，其中矢车菊素-3-（2G-葡糖芸香糖苷）、飞燕草素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖苷和矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷在桑椹花色苷中被首次报道。

4纸色谱-高效液相色谱-电喷雾质谱技术

 纸色谱( PC)始于20世纪40年代，是花色苷早期分析采用的经典方法，该方法根据花色苷在不同溶剂中的比移值( Rf)和颜色对其定性分析。纸色谱成本低、分析迅速以及能对花色苷进行初步定性，但当样品中的化合物较复杂时，很难对其准确分析和鉴定。Hassimotto等用SPE（聚酰胺）小柱纯化巴西野生桑椹（Morus nigra L．）花色苷后，使用PC( Whatman，3 mm)分离得2种单体，经UV-Vis光谱，HPLC/DAD和ESI-MS/MS鉴定为C3G和C3R，含量

分别为总花色苷含量的71%和19%，高于栽培的桑椹品种，且类黄酮物质（含花色苷）的抗氧化活性强于槲皮素和合成的抗氧化剂（如BHT）。

5  高速逆流色谱-高效液相色谱-电喷雾质谱技术

 该技术先用HSCCC将桑椹提取物中花色苷分离成不同的馏分，再利用HPLC-ESI/MS对其定性和定量分析。HSCCC在分离制备高纯度的化合物时，具有高效、快速、简便以及为标品的制备和扩大化生产提供参考，分离花色苷使用的溶剂体系为：甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水（配以少量的三氟乙酸）。杨玲等经Dl01树脂纯化新疆药桑花色苷后，采用HSCCC分离花色苷得4个馏分，纯度分别为99.24%，88.5%．99.9%和96%，通过C3G标品色谱图对比可推测出：馏分1和3可能为矢车菊素，馏分2和4可能为同一苷元，经UV-Vis光谱、MS鉴定，确定馏分1，2，3和4分别为C3R，P3R，C3G和P3G。2014年，Sheng等使用HSCCC分离桑椹（Morus albaL）粗提取物中花色苷得到4个馏分，经HPLC-UV、ESI-MS/MS鉴定，第1个馏分为非花色苷类混合物，第2~第4个馏分分别为矢车菊素-3-0-（6”-O-鼠李糖-葡萄糖苷）( C3R)、矢车菊素-3-0-（6”-0-鼠李糖-半乳糖苷）( C3RGa)和牵牛花素-3-葡萄糖苷(Pt3G)，3种花色苷的纯度大于95%。

6  多种技术联合使用

 2008年，Du等用Amberlite XAD-7树脂纯化杭州桑椹（Morus albaL）花色苷后，以甲基叔丁基醚一正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸（1：3：1：5：0.001，体积比）为溶剂系统，采用HSCCC分离得到5个馏分．经HPLC，ESI-MS和NMR分析确定5个馏分为5种花色苷，其中C3RGa、C3Ga（矢车菊素-3-半乳糖苷）和C7G（矢车菊素-7-葡萄糖苷）第一次被报道。该小组同时还研究了5种单体花色苷及桑椹粗提物的抗氧化活性：桑椹粗提物、C3G、C3Ga和C7G的DPPH清除能力大于C3RG和C3RGa，当花色苷及粗提物质量浓度达到0.40 mg/m L以上，粗提物的DPPH清除能力强于5种单体花色苷。Qin等采用Waters RP Cl8色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈-三氟乙酸-水为流动相，PAD检测器检测陕西周至县桑椹（MorusalbaL-）花色苷得到4个峰，经UV-Vis光谱、LC-MS和'HNMR鉴定得到：C3G、C3R、P3G和P3R，其中C3G和C3R的含量分别为60%和38%。综合以上研究，归纳了桑椹中花色苷的质谱信息（如表1所示）。

7结论与展望

 桑椹花色苷作为天然植物中的一种水溶性色素，具有保健和药理价值。对于桑椹花色苷的结构鉴定已从UV-Vis光谱发展到多种技术的联合使用。NMR在对花色苷中糖苷同分异构体和酰基化位点的确定具有优势，而HSCCC的使用则能使桑椹提取物中花色苷分离成高纯度的单体。Morus atropurpurea Roxb品种中花色苷的种类多达8种；黑桑椹(Morus nigraL．)和白桑椹（Morus albaL．）中主要的花色苷为C3G和C3R(含量分别为总花色苷的53.94%～78.23%和19%～43.83%)，且C3G和C3R的抗氧化活性强于其他花色苷，这与花色苷的结构和含量有密切的关系。由以上结果可见，桑椹中花色苷的种类和含量与桑椹品种、栽培地的气候、土壤及桑树的修剪、病虫害防治等因素有关。上述鉴定结果，为了解各种桑椹含有花

色苷的种类和结构提供了试验数据，为桑椹花色苷资源的进一步开发利用奠定了基础。

 随着人们对天然花色苷需求量的增大，花色苷的分离制备也成为了目前国内外研究学者的重点，相比半制备型HPLC、PC、离子交换树脂、凝胶树脂和大孑L树脂等单独使用或联用而言，HSCCC分离制备高纯度单体花色苷更具有高效、简便和省时等特点。近十年来，HSCCC在制备高纯度天然产物方面已从毫克量级制备到了克量级，这对于高纯度样品的制备显示出很好的优势。虽然花色苷的分离制备得到发展，但对于桑椹中花色苷与抗氧化活性作用的机理有待深入的研究，这将有助于花色苷在食品、药品及保健品行业中发挥巨大的作用。