簕菜提取物及其化学成分对a-葡萄糖苷酶的抑制作用

 李晨悦1，李冬利2*，孙玉坤3，张桐苇1，董字琴1，张煜1， 2*

 1．广东工业大学轻工化工学院（广州510006）；2．五邑大学化学与环境工程学院(江门529020)； 3．中国农业大学食品科学与营养工程学院(北京100083)

摘要试验采用以对硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物的酶抑制剂筛选模型测定了簕菜提取物及其化学成分对a-葡萄糖苷酶的抑制作用，为簕菜降血糖作用提供试验证据。试验结果表明，不同部位的簕菜中的抑制a-葡萄糖苷酶的活性物质都可以通过有机溶剂萃取步骤进行浓缩；簕菜叶、茎和根的乙酸乙酯层都表现出最高的抑制活性：簕菜乙酸乙酯层的9个萜类和6个多酚类化学成分中，二萜化合物ent-kaur-15-en-17-al-19-oic aad和多酚化合物异绿原酸C具有最好的抑制a-葡萄糖苷酶的活性，均高于对照品阿卡波糖，它们可能是簕菜提取物具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的作用成分。

关键词簕菜；提取物；化学成分；a-葡萄糖苷酶；抑制剂

 筋菜，学名为白筋(Acanthopanax trifoliatus( Linn) Merr．)，又称鹅掌簕、三叶五加、三加皮、苦刺、刺三加，为五加科( Araliaceae)五加属（Acanthopanax）植物。广泛分布于我国中部和南部，印度、菲律宾、缅甸、泰国、越南和孟加拉国等地也有分布。簕菜是药食两用植物，筋菜产地民间自古就有采集簕菜作为鲜食蔬菜和保健药材的习俗。筋菜在广东江门市的恩平等地盛产，并且十多年前已经开始了人工种植。据当地居民所言，长期食用簕菜可以降血糖。但到目前为止，仍鲜见有关于簕菜降血糖作用方面的研究报道。因此，仍缺乏簕菜

降血糖作用的科学依据。试验采用以对硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷( PNPG)为底物的酶抑制剂筛选模型测定了筋菜提取物及其化学成分对a-葡萄糖苷酶的抑制作用，以期为簕菜降血糖作用提供一定的试验证据。

1  材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

 筋菜：2012年4月份采于广东省江门市恩平雪壮筋菜厂，经中国科学院华南植物园叶华谷研究员鉴定为五加科植物簕菜。

 a-葡萄糖苷酶、牛血清白蛋白( BSA)、对硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)：美国Sigma-Aldrich公司；拜唐苹（每片含50 mg阿卡波糖）：拜耳医药保健有限公司；其它试剂：国产分析纯。

 Infinite F200多功能酶标仪：奥地利TECAN公司；单道、多道移液器：德国Eppendorf公司；96孔酶标板：德国Greiner公司。

1.2方法

1.2.1簕菜提取物的制备

 采集筋菜新鲜叶、茎和根，常温干燥后粉碎，分别取出200 g，加入体积分数为95%食用酒精进行冷浸提取，每隔ld进行过滤，共提取3次，合并提取液，用旋转蒸发仪进行浓缩得不同部位的醇提物（叶：L；茎：S；根：R）。各醇提物依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，浓缩干燥后分别得到石油醚层（叶：LP；茎：SP；根：RP）、乙酸乙酯层（叶：LE；茎：SE；根：RE）、正丁醇层（叶：I LN;茎：SN;根：RN）。所有提取物真空干燥后均4

1 0C保存备用。

1.2.2簕菜化学成分的获得

 筋菜乙酸乙酯层提取物经反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、反相硅胶柱层析、制备薄层层析( pTLC)、MCI树脂柱层析等分离手段，分离纯化得到单体化合物，综合运用现代波谱技术(IR、UV、MS、1H-NMR、13C_NMR、DEPT、1H-H COSY、HSQC、HMBC)以及与文献比对确定了9个已知的萜类化合物的结构（见图1），它们的化学

试验数据将另文发表。

  通过UPLC-DAD-Q TOF MS及与标准品对照分析簕菜提取物中的多酚类化学成分，发现其中主要含有绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C和芦丁，还含有少量的新绿原酸和隐绿原酸。试验中所用的这些酚类化合物均购自成都普瑞法科技开发有限公司，纯度为HPLC≥98%。

1.2.3  a-葡萄糖苷酶活性测试

 a-葡萄糖苷酶溶液的配制：将酶冻干粉用0.1%BSA溶液溶解，配成100 U/m L的酶液，置于-20℃的冰箱中冻存。试验前，将100 U/m L酶液用移液枪吸取少量，先用0.1% BSA溶液稀释到20 U/m L，再用0.1%BSA溶液稀释到0.2 U/m L备用。

 PNPG溶液配制：称取一定量的PNPG固体，用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，配成浓度为10 m mol/L，然后用1.5 m L的离心管分装备用。

 试验采用比色法测定a-葡萄糖苷酶的活性。用二甲基亚砜( DMSO)溶解待测簕菜提取物或化合物，配制质量浓度为10 mg/m L的备用溶液。再用PBS稀释备用溶液，配置成所需浓度的待测溶液。在96孔板每孔中加入筋菜提取物或者化合物溶液（试验组）、阿卡波糖溶液（阳性对照组）或PBS（阴性对照组）10μL，PBS 50μL，酶溶液20 μL，摇匀，置于37℃水浴恒温10 min，然后加入PNPG溶液20μL，摇匀，37℃反应10 min，再加入Na2CO3终止液30 111终止反应，立即于405 nm处测定吸光度。样品对a-葡萄糖苷酶的抑制率按下式计算：抑制率=（阴性对照组吸光度一试验组吸光度）／阴性对照组吸光度×100%。当样品对a-葡萄糖苷酶的抑制率为50%时，将样品质量浓度定为半数抑制浓度( IC50)。

2结果与分析

2.1  筋菜提取物对a-葡萄糖苷酶的抑制活性

 经过初步筛选可知（图2），在筋菜的提取物中，当样品作用浓度为1mg/m L时，筋菜叶、茎、根的提取物的抑制率分别为28.5%(L)，25.3%(S)和44.1%(R)，通过有机溶剂萃取分层后的提取物中，筋菜叶、茎、根的乙酸乙酯层都表现出最高的抑制率( LE: 97.3%; SE: 66.5%; RE: 77.3%)，并且都高于阳性对照阿卡波糖(59.1%)，说明不同部位的簕箭菜中的降糖活性物质都可以通过有机溶剂萃取步骤进行浓缩。

2.2筋菜化学成分对a-葡萄糖苷酶的抑制活性

 从筋菜乙酸乙酯层中分离获得了9个已知的萜类化合物，另外鉴定了筋菜提取物中还含有绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、芦丁和少量的新绿原酸和隐绿原酸。试验测定了这些化合物抑制a-葡萄糖苷酶的活性。结果见图3，当作用浓度为0.1 mg/m L时，簕菜中含有的二萜化合物6和多酚化合物异绿原酸C具有最好的抑制a-葡萄糖苷酶的活性，抑制率分别为36.5%和3 1.2%，均高于对照品阿卡波糖的抑制率20.7%。

 进一步测定化合物6和异绿原酸C在不同浓度下对a-葡萄糖苷酶的抑制率（见表2），利用SigmaPlot软件绘制药物浓度一抑制率曲线（图4），算出化合物6和异绿原酸C的IC50分别为146.5μg/m L和198.2μg/m L，均显著低于阿卡波糖的IC50（512.5μg/m L）。说明这2个化合物对a-葡萄糖苷酶的抑制活性优于阿卡波糖，它们可能是筋菜提取物具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的作用成分。

3讨论与结论

 虽然目前为止未见有关于筋菜降血糖作用方面的研究报道，但有研究报道了同属植物刺五加的根和茎皮具有降低糖尿病大鼠或小鼠胰岛素抵抗的作用，也有研究报道了刺五加茎皮和叶都具有抑制a-葡萄糖苷酶的活性，从中得到的活性化合物主要是多酚类和黄酮类化合物。另有文献报道很多植物来源的多酚类或黄酮类化合物都有抑制a-葡萄糖苷酶的活性，Gao等报道款冬花蕾的二咖啡酰奎宁酸类化合物能选择性地抑制大鼠小肠来源的麦芽糖酶活性。试验研究也表明筋菜中的二咖啡酰奎宁酸类化合物具有较好的抑制a-葡萄糖苷酶的活性，并且二咖啡酰奎宁酸类化合物（异绿原酸C、异绿原酸A）的活性强于单咖啡酰奎宁酸类化合物（绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸），这一发现与文献报道结论相符。此外，文献报道贝壳杉烷类二萜化合物16-kauren-19-oic acid具有抑制a-葡萄糖苷酶的活性，试验研究也发现簕菜中的二萜类化合物ent-kaur-15-en-17-al-19-oic acid(6)具有很强的抑制a-葡萄糖苷酶的活性。因此，簕菜提取物的抑制a-葡萄糖苷酶的活性可能是2种活性成分共同作用的结果。簕菜作为一种药食两用植物，其降血糖作用具有进一步研究和开发的价值。