田坤云，崔学锋，张瑞林
（1．河南工程学院安全工程学院，河南郑州451191；
2．河南理工大学安全科学与工程学院，河南焦作454003）
摘要：为了研究好氧型微生物对低氧气浓度环境条件下煤吸附甲烷的降解效能，培养、分离、初步鉴定了高效降解甲烷的好氧型甲烷氧化菌。并在高压容量法瓦斯吸附一解吸装置的基础上，自主开发了低氧环境下甲烷降解实验分析系统，研究了氧气浓度为0010、5%和15%三种条件下甲烷氧化菌的降解效能，通过对实验前后甲烷减少量，二氧化碳增加量，氧气减少量进行分析。结果表明：在氧气浓度(0%~15%)范围内，随着氧气浓度升高及降解时间的持续，甲烷的减少量可达130.5 cm3，二氧化碳的增加量最高可达25.7 cm3，同时最多消耗69.0 cm3氧气；在无氧条件下，好氧型甲烷氧化菌的生理活性受到了一定的限制，但最高仍然可以降解11.9 cm3的甲烷，生成二氧化碳3.5 cm3。
关键词：甲烷氧化菌；好氧型；低氧环境；降解效能
0 引言
煤层瓦斯（主要成分是甲烷）是煤矿开采过程中的主要致灾气体，它不仅作为一种窒息性气体严重污染井下作业环境，而且还是导致瓦斯异常涌出和煤与瓦斯突出的主要动力源。随着通过加强通风、加强瓦斯抽放及综合通风与瓦斯抽放的瓦斯综合治理技术向深部开采的挺进，地应力升高，煤层透气性降低等因素的制约已使之处于理论和技术的瓶颈，迫切需要寻找预防及治理煤层瓦斯灾害的新技术、新方法。1939年，A．3．尤洛夫斯基提出利用甲烷氧化菌氧化煤矿瓦斯以降低煤矿瓦斯浓度的构想后，国外便开始了对甲烷氧化菌应用于煤矿降低瓦斯的探索。20世纪70年代，俄罗斯生命科学院和采矿研究院的专家把配置好的甲烷氧化菌液直接注入到煤层中，在鼓风供氧的条件下使该处的瓦斯浓度降低了300/0~60%。陈东科等在煤样中加入M3011和GYJ3的甲烷氧化混合菌，通过电镜分析，两种甲烷氧化菌附着在煤样孔隙表面，均生长良好，试验中煤样瓦斯平均降解率为44 010，最高达52%。重庆大学博士生毛飞通过在煤矿井下进行微生物瓦斯处理实验发现甲烷氧化菌能够较大程度地降低实验地点的瓦斯动力现象，回风流中瓦斯浓度分别降低了22. 54%和77. 23%吨煤瓦斯含量分别降低了39. 67%和13. 45%河南工程学院张瑞林等在实验室条件下以构造煤为研究对象，实验证明甲烷氧化菌AEM1235菌悬液在压力(1 ~5 MPa)高瓦斯压条件下仍具有较好的降解能力。
以上一系列研究成果均表明，烷氧化菌在煤矿瓦斯治理方面具有广阔的应用前景。然而，由于煤层瓦斯含量不仅极低，而且还处于动态变化之中，本文自行设计了好氧型微生物降解甲烷实验分析系统，考查在常压、低氧气浓度条件下好氧型甲烷氧化菌对煤吸附甲烷的降解效能，以期为煤矿瓦斯治理及瓦斯灾害预测防治提供一点参考。
1 甲烷氧化菌分布分类及氧化机理
1.1 甲烷氧化菌的分布分类
甲烷氧化细菌( methane oxidizing bacteria)是一类可以甲烷为唯一碳源和能源生长的微生物，在自然环境中有着广泛的分布，在森林土壤、自然湿地、下水道淤泥、垃圾填埋场、油井附近土壤、沼泽地、火山喷发口处，强酸性、强碱性及极地冻土带等极端环境中都发现它们的存在。除少部分生活在极端生境的甲烷氧化菌外，大多数甲烷氧化菌为喜中性，表土层5~ 10cm深处土壤类型和透气性符合其生长条件，甲烷氧化菌数量最多。
以细胞生理学为基础，甲烷氧化细菌可以分为甲烷同化细菌( methane - assimilating bacteria MAB)和甲烷共氧化细菌( autotrophic ammonla - oxidizing bacteriaAAOB)，一般所说的甲烷氧化细菌指的是甲烷同化细菌，这种细菌可以利用甲烷来获取自身所需要的能量。好氧型甲烷氧化菌根据需氧量的多少可以细分为①专性好氧型甲烷氧化菌；②微需氧好氧型甲烷氧化菌；③兼性厌氧型甲烷氧化菌。专性好氧型甲烷氧化菌在代谢过程中需要足量氧气，没有氧气或氧气不足将终止代谢过程；微需氧好氧型甲烷氧化菌在代谢过程中也需要氧气，但需氧量较少，没有氧气将终止代谢过程，而氧气充足条件下代谢活动也会受到抑制；兼性厌氧型在氧气充足的条件下生长良好，但是在没有氧气条件下也能生长，但生长情况弱于有氧气条件下。具体的分类情况见表1。
根据形态、膜结构、G+C mol%、16S rRNA测序、代谢途径等系列特征可以把甲烷氧化菌分为typel型、ty-pell型和type X型，I型甲烷氧化菌主要含C16脂肪酸，胞内膜成束状分布，主要利用5-磷酸核糖途径来同化甲醛。II型甲烷氧化菌属于变形菌纲a亚纲，胞内膜分布于细胞壁内侧，通过丝氨酸途径氧化甲醛，X型的甲烷氧化菌同样利用Rump途径氧化甲醛，但是甲烷氧化菌含有较低水平的丝氨酸途径所需要的二磷酸核酮糖磷酸酶。II型和X型甲烷氧化菌能固氮而大多数I型甲烷氧化菌不能。
1.2 甲烷氧化菌氧化甲烷机理
在化学上实现甲烷到甲醇的直接转化是非常困难的，然而甲烷氧化菌在自身含有甲烷单加氧酶( Methanemonooxygenase．MMO)的作用下将甲烷氧化成甲醇，甲醇进而在甲醇脱氢酶的作用下被氧化为甲醛。生成的甲醛一部分通过丝氨酸途径( SERINE PATHWAY)或通过戊糖二磷酸途径( RuMP PATHWAY)合成细胞物质。另一部分甲醛则在甲醛脱氢酶作用下转化为甲酸，甲酸进而被氧化分解成CO，和H：0，CO：则重新回到大气碳库中。甲烷氧化菌的氧化机理如图1所示。
2 实验过程
2.1 菌种的培养
本次实验中所使用的菌种是以信阳市天梯水稻田土壤作为富集源，经过反复转接培养，培养过程中优化所使用的NMS培养基，调整培养基内CuSO4．5H20至0. 03 mg/L，调整pH至6.5，优化生长温度为30℃，恒温摇床转速为120 r/min，经格兰仕染色，吲哚实验，高倍电子显微镜观察等筛选出的高效降解甲烷的好氧型甲烷氧化菌株，实验结果如表2所示。
2.2 实验煤样
从河南洛阳新安煤矿二，煤层打孔钻芯取样，包裹严实带回实验室，经由球磨机磨碎，最终用筛网筛取粒度为0. 20~0.25 mm煤样，放置于真空干燥箱中(80℃，-0.1 MPa)保存备用。
2.3 实验用气体及仪器
甲烷高压气体钢瓶[纯度99. 99 010，(13.0±0.5)MPa]，氧气高压钢瓶[纯度99. 99%，(13.0±0.5)MPa]，AUM -2滚筒式球磨机，气体混合装置，D08 -1GM型气体质量流量计，XSE电子分析天平，FZG系列真空干燥箱，FS -5瓦斯解吸仪，HAC -1高压容量法瓦斯吸附一解吸装置，GDH - 0506超高精度恒温槽，罗兹ZJ - 30真空泵，安捷伦7890a气相色谱仪。
已有的好氧型甲烷氧化菌降解煤吸附瓦斯实验系统往往只能在单一有氧或无氧的条件下进行，然而煤系地层是在反复沉降变质作用后形成的，氧气含量不仅很低，而且区域分布上具有明显的不均衡性，因此依据甲烷吸附一解吸实验装置设计出一种低氧浓度环境下甲烷降解实验分析系统如图2所示，进气管路上气体质量流量计不仅可以显示瞬时流量还可以显示累计流量，通过调节气体质量流量计就可以精确控制甲烷和氧气不同混合比例，充气完毕关闭减压阀，打开气体混合装置中间的开关静置30 min就可以使两种气体充分混合，为了校验气体的真实浓度还在气体混合装置上方开设有放气口，可以收集混合气体通过气相色谱仪检测分析气体组分，实现了对气体浓度的双重控制。吸附罐增设有压力表可以对吸附罐的充气压力进行调节控制，本次实验研究的是在常压下甲烷氧化菌的降解效能，因此若吸附罐中压力增高则可以调节放气阀，使罐内的气体恢复常压。降解完成后由真空脱气装置抽取吸附罐内气体，经由气相色谱分析气体组分。
2.4 实验过程
主要研究在低氧气浓度下好氧型甲烷氧化菌的降解效能，因此共进行三个水平实验，每一个水平设置三组对比实验，最后，每一水平实验求取平均值作为最终结果。实验中分别控制氧气浓度为0%，5%和15%．而吸附罐充气压力则控制在常压条件下，实验中每个吸附罐中均加入10 ml菌液。
实验过程包括：气密性检查，装样，喷洒菌液，脱气，充气及脱气分析等过程。氧浓度为15%条件下降解煤吸附甲烷的步骤：
①对整个管路系统抽真空，以排除残留空气。打开甲烷、氧气钢瓶开关及减压阀，通过气体减压阀调节气体质量流量计读数使甲烷和氧气的比例控制在17:3。
②关闭高压气体钢瓶减压阀，打开混合装置中间的针型阀，静置混合10 min，在放气口采集混合气体并用气象色谱仪分析其组分。
③将吸附罐装入粒度为0.2~0. 25 mm真空干燥煤样45 g，分层喷洒菌液10 ml，并使其混合均匀。拧紧吸附罐上的螺丝，真空脱气10 min（以避免长时间脱气对甲烷氧化菌的活性造成影响），打开气体混合罐出口阀门及吸附罐阀门使煤样吸附甲烷30 min，关闭吸附罐针型阀，放置在30℃恒温水浴中进行降解实验。
④12 h后开启真空脱气装置抽取吸附罐中气体使其涌入瓦斯解吸仪，读出放气体积，并由气相色谱仪分析气体组分。
3实验结果分析
对每一水平中各组煤样进行实验，并进行气体成分分析计算，取得的实验数据如表3所示，计算出二氧化碳的增加量并绘制图形，如图3所示。
从图3中可以看出随着氧气浓度的升高，二氧化碳的增加量也迅速增多，12 h后这种增加量逐渐趋于停止，说明甲烷氧化菌的生命活动趋于停滞，可能随着降解时间的进行，甲烷氧化菌失去了理想的生存环境而失去降解能力，然而从另一方面间接证明了降解实验时间选择在12 h是合理的。在无氧环境中二氧化碳也有一定程度的增加。二氧化碳的增加量是甲烷氧化菌新陈代谢活动的象征，然而实验过程中仅仅分析二氧化碳的增加量是尚不够的。许多研究已经证实，二氧化碳的吸附能力要明显大于甲烷，生成的二氧化碳可以对吸附甲烷进行有效的置换，因此必须对降解过程中甲烷的减少量做出进一步的研究。
从图4中可以看出，随着氧气浓度的升高，甲烷的减少量在逐渐的增多，随着降解时间的持续甲烷的减少量也在不断的增加，然而这种增加量逐渐地减少，可以看出三条曲线最终趋于平缓。在氧气浓度为0%的条件下，甲烷的减少量也并非为0，而是有一定程度的增加，可能是类似于兼性厌氧微生物的巴斯德效应一样，缺氧条件下细胞呼吸作用受到抑制，细胞为了获得更多的能量则不断消耗底物，然而这种无氧呼吸很快就停止了。同时也发现在无氧条件下甲烷氧化菌吸收利用甲烷的能力相比有氧环境下明显降低。
氧气在甲烷氧化菌的降解过程中同样处于核心地位，因此有必要了解其变化过程。
从图5中可以看出，在氧气浓度为5%和15 010条件下氧气含量都有一定程度的减少。氧气浓度越大，氧气的减少量就越多，可能在氧气浓度大的条件下，氧气和所注入的好氧菌有了更大面积接触；同时也激发了某些类型酶的活性，因此消耗了更多的氧气。
4 结论
1)通过对富集的好氧型甲烷菌种进行分离、纯化、初步鉴定，得到了适合稀氧条件下仍然具有较好降解能力的微生物菌种。
2)为了研究常压、低氧环境下好氧型甲烷氧化菌对煤吸附甲烷的降解性能，开发了甲烷降解实验分析系统，满足了实验需求。
3)实验过程中通过改变氧气浓度，最后得出一致结论：无氧环境中该型甲烷氧化菌的生理活性虽然受到了限制，然而仍可以进行一段时间的降解活动。在氧气浓度(0%~15%)范围内随着氧气浓度的升高，甲烷和氧气的减少量都得到增加，这一规律由降解最终产物二氧化碳气体的增加量变化得到了比较充分的佐证。
