1-磷酸鞘氨醇受体在心肌梗死后心室重塑过程中的变差异

李军，郭艳丽，薛剑，宁世锋，于农，吕双红，刘安恒，张孝忠

军事医学科学院附属医院心血管内科，北京100071

[摘要]  目的：探讨1-磷酸鞘氨醇(SIP)不同受体亚型(SIP1、SIP2.SIP3)在大鼠心肌梗死后心室重塑过程中的变化差异。方法：通过结扎大鼠左冠状动脉前降支，建立大鼠心肌梗死模型，在心肌梗死后1、4、8周，采用实时荧光定量PCR的方法，分别检测心脏非梗死区、梗死区、正常对照心肌组织SIP1、SIP2.SIP3的mRNA相对表达。结果：心梗后心室重塑阶段，SI Pl mRNA的表达水平在非梗死区与梗死区的下降程度不一致，1周组非梗死区与正常对照组比较无统计学差异，而在梗死区2组间差异有统计学意义(P<0.05)，在梗死区降低趋势更为明显。SIP2 mRNA在术后各组的非梗死区与正常对照心肌之间的表达比较，变化无统计学意义，且各时间点之间无差异，而在梗死区其表达变化较为显著(P<0.01)。SIP3 mRNA在心梗后1周表达显著增强(P<0.01)，4周表达出现降低，这种表达抑制在梗死区更为明显（P<0.01和P<0.05）。结论：心室重塑阶段的SIP1、SIP2 .SIP3  mRNA表达在非梗死区与梗死区变化不同步且各有特点，这种差异表达可能在心肌梗死后心室重塑过程中有重要意义。

[关键词]  1-磷酸鞘氨醇；心肌梗死；心室重塑；1P磷酸鞘氨醇受体

[中图分类号]R542.2  [文章编号]  1009-0002( 2016)02-0178-05

 1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，SIP）来源于鞘磷脂代谢，是一种重要的脂质调控分子，其既可作为细胞内第二信使发挥作用，又可通过与细胞表面的特定受体结合而发挥广泛的生物学效应，研究证实，在细胞的增殖、存活、迁移、凋亡等方面，SIP起到了重要的调节作用。在心血管疾病方面，在缺氧和缺血／再灌注诱导损伤的情况下，对于体外培养的心肌细胞和心脏功能，SIP都是公认的保护调节分子。尤其在抑制心肌细胞凋亡、心肌缺血／再灌注损伤的保护等方面作用显著。这些生理功能主要通过与其不同受体的作用而产生。SIP的受体曾被命名为内皮分化基因(EDG)，这类受体与SIP有很高的亲和力。根据国际药理学联盟的命名规范，2002年SIP相关受体被命名为SIP1、SIP2、SIP3、SIP4、SIP5171，在心血管系统主要分布SIP1、SIP2和SIP3。SIP与这些受体结合，可诱导多种信号通路的激活或抑制，引发不同生物学效应。研究表明，SIP通过SIP1促进缺氧的心肌细胞存活，对心肌细胞起保护作用。而除了保护作用，一些关于SIP通过其受体促进心脏纤维化的作用也有报道，甚至有学者提出SIP3在SIP产生的促纤维化过程中扮演关键角色。心室重塑是心肌梗死后心力衰竭发生发展的中心环节，心脏成纤维细胞的激活和间质纤维化是重要的病理过程。心室重塑的本质是一种功能性、代偿性和适应性的变化，但持续发展会引起心脏结构和功能出现不可逆、致病性改变。但是，有关SIP不同受体在梗死后心室重塑中的变化仍不清楚。在此，我们探讨心肌梗死后心室重塑阶段SIP受体的变化差异，以期帮助我们进一步理解SIP在心脏的作用，为改善心肌梗死患者预后提供新的研究思路。

1  材料和方法

1.1材料

 成年SPF级SD大鼠(220—250 g)由军事医学科学院实验动物中心提供[许可证号：SCXK-（军）2012-0004]。随机分为4组，即正常对照组、1周梗死组、4周梗死组和8周梗死组。

 实时定量逆转录试剂盒(TOYOBO ReverTraAce qPCR RT Master Mix with gDNA Remover);

水合氯醛注射液（国药集团化学试剂有限公司）；SYBRPremix ExTaq（TaKaRa公司）；引物（表1）由TaKaRa公司设计合成并验证。

 心电图机（ECG-9130P，日本光电公司）；动物呼吸机（ALC-V8，上海奥尔科特生物科技有限公司）；高通量组织破碎仪（TL-48P，上海万柏公司）；RNA专用工作台（Heraguard ECO，美国赛默飞公司）；荧光定量PCR仪（Bio-Rad IQ5，美国伯乐公司）；酶标仪（DG5033B，杭州汇尔公司）。

1.2动物模型制备与取材

 心肌梗死后心室重塑动物模型采取开胸手术，结扎左冠状动脉前降支(left anterior descending ar-tery，LAD)的方法。给予腹腔注射麻醉，气管切开，连接小动物呼吸机辅助呼吸，无菌条件下开胸，于LAD起始处下2 mm处结扎，结扎确实后心肌前壁颜色变白，室壁运动减弱，蘸去胸腔内出血，逐层缝合胸腔；术后5 min连接肢体6导联心电图，出现I、Ⅱ、μL导联ST段显著抬高进一步提示冠脉结扎成功（图1）。术后给予大鼠保温，连续3d给予青霉素肌肉注射，15万U/d。室内饲养，正常提供饮食、饮水。手术、注射等操作方法。

 术后1、4、8周，采取尾静脉静推10%氯化钾注射液的方法处死各组大鼠，立即开胸，摘取心脏，剪除心底部血管，用0～4℃冷PBS灌洗心腔，滤干后称重。梗死部位通常较为明显，将梗死交界区附近2mm左右组织剪去，以控制梗死区及非梗死区之间样品的混杂。分离出左室非梗死区和梗死区心肌组织，迅速在液氮中速冻，存于-80℃冰箱待检测。

1.3  RNA提取和实时荧光定量PCR检测

 利用TRIzol法提取RNA，再采用反转录试剂盒反转录为cD NA。RT- PCR反应体系20I.L1包括SYBR Premix Ex Taq 10μL，上、下游引物(10μL mol/L)各0.8 μL,cD NA lVL,dH:0 7.4 VL。扩增参数：第一步骤95℃持续30 s变性；第二步骤以95℃10 s、60℃30 s、72℃ 30 s反复40个循环；第1步骤制作溶解曲线，70~90℃每5s读数一次，记录结果。各组mRNA表达水平通过相对定量方法与管家GAPDH基因标准化后得出。

1.4结果分析

 同一受体3个时间点与正常对照组之间的数据符合方差分析条件，利用Graphpad Prism 6软件对多组进行方差分析，P<0.05具有统计学意义，并利用该软件做图。

2结果

2.1  实验大鼠的存活状态

 共使用大鼠35只，存活至实验终点25只，其中正常对照组5只，1、4、8周组依次有6.6、8只。图1为大鼠心肌梗死模型心电图。

2.2 SIP受体mRNA表达水平的变化

 心肌梗死后非梗死区与梗死区的SIPl mRNA表达水平与正常对照组比较有下降趋势（图2），但二者下降程度并不一致：非梗死区SIPl mRNA在4周才观察到有统计学意义的降低(P<0.05)（图2A）；而在梗死区1周即观察到显著变化(P<0.05)，此后的4周组较1周组降低趋势更为显著(P<0.01)，其后的8周组与4周组比较，差异无统计学意义（图2B）。

 心肌梗死后非梗死区与梗死区SIP2 mRNA在非梗死区与梗死区表达变化趋势差别明显（图3）。非梗死区SIP2 mRNA在心梗后各时间点变化无统计学意义（图3A）。而在梗死区SIP2 mRNA表达变化较为明显：1周即出现显著降低(P<0.01)，并持续至心梗后4周左右，第8周表达显著回升(P<0.01)，但表达水平低于正常对照组(P<0.01)（图3B）。

 非梗死区、梗死区SIP3 mRNA表达在心梗后1周与正常对照组相比显著上调(P<0.01)（图4），在4周组可观察到mRNA表达受到抑制，梗死区较为明显，持续抑制至8周并低于正常对照组水平(P<0.01)（图4B）；非梗死区这种抑制现象较为平缓，8周组与正常对照组之间差别无统计学意义（图4A）。

3讨论

 对SIP及相关受体在心血管疾病方面的研究主要集中在心肌的急性损伤，而关于心室重塑阶段的研究文献较少，且研究结果不一致，特别是关于SIP受体功能的研究争议较大。心肌梗死后心室重塑是一个慢性缺血、缺氧过程。我们采取目前国际公认的心室重塑的手术造模方法，对心肌梗死后心室重塑阶段心肌组织SIP受体mRNA表达的变化差异进行了研究。

 本研究观察到心肌梗死后重塑阶段，非梗死区SIPl mRNA的表达水平下降，这与Yeh的报道基本一致：小鼠心肌梗死后2周SIPl mRNA表达水平较假手术组显著降低，并持续降低至12周，而且我们发现在梗死区SIP1的mRNA表达降低更为显著。我们推测心室重塑过程中伴有SIPI信号减弱，在梗死早期如果增强SJP1信号，对于促进心肌细胞存活，保护心功能有益。事实上，这一点已有文献支持：心梗后2周给予SIP1选择性激动剂SEW2871,会减少非梗死区心肌细胞的凋亡，也会增强心肌功。这提示，SIP1受体激动剂对心肌梗死后心力

衰竭具有潜在的治疗作用。研究证实，SIP2在细胞迁移、维持内皮细胞功能等方面扮演重要角色，但有关心肌梗死后SIP2的研究报道较少。有学者通过干预实验发现，给予SIP2受体拮抗剂JTE-013，可以消除心力衰竭相关的肌源反应，但SIP2在重塑阶段扮演何种角色仍须进一步研究证实。在鼠类的心梗早期及缺血／再灌注研究中发现SIP2 mRNA表达没有显著变化。我们通过实验发现，在重塑阶段非梗死区的SIP2 mRNA表达水平也较为恒定，但在梗死区的表达情况则完全不同，各组间变化趋势明显，差异显著。SIP2主要表达在血管内皮细胞，我们推测这种表达的差异与非梗死区、梗死区之间病理变化导致组织成分的改变有关，具体机制需要进一步探讨。SIP3是近年来组织、器官纤维化研究的一个热点，学者提出SIP3参与了鞘氨醇激酶一l过表达导致的心脏纤维化过程。心室重塑是心梗后心力衰竭的不可逆改变，伴随着心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，令人费解的是在我们的研究中，从心梗后4周开始，无论梗死区或非梗死区．SIP3 mRNA的表达却呈降低趋势，是否存在一种负反馈机制，抑制了SIP3 mRNA的表达，启动了心脏的“自救”途径，值得深入研究。

 至今罕有关于SIP受体在心肌梗死后心室重塑中作用的文献报道。目前还未见关于心梗后梗死区SIP1、SIP2、SIP3 mRNA变化趋势的报道。大多数心室重塑的研究局限于非梗死区，这与传统心室重塑概念有关。心室重塑的最初定义是远离梗死区域的心肌组织的变化以及由急性心梗转为慢性心衰的进展过程。近年关于心力衰竭机制的研究逐渐深入，干细胞、组织工程等新技术应用于医学研究甚至临床治疗，心室重塑这一传统概念有待改变。2014年心脏病学家Heusch等阐述了一个更为“广义”的心脏重塑概念，打破了“非梗死区的局限”。而且研究证实SIP可以通过诱导造血干细胞到瘢痕区域，刺激梗死组织再生，提高心脏功能。所以梗死区不是心室重塑研究的禁区，更不应当忽略其潜在研究价值。