水稻OmR40cl蛋白的表达纯化及其与血红细胞的凝集作用

陈贤1，2，邓志平2，董岩3，严成其2，陈剑平1，2

1．浙江大学农业与生物技术学院，浙江杭州310029；2．浙江省农业科学院病毒与生物技术研究所，浙江杭州310021；3．南京农业大学植物保护学院，江苏南京210095

[摘要]  目的：在大肠杆菌中融合表达水稻蛋白OmR40cl，并探讨其与红细胞的凝集效果，为进一步研究OmR40cl在体外的抑菌实验做准备。方法：PCR扩增目的基因，经BamH I及NotI双酶切，连入表达载体pCEX-6p-1构建成重组质粒，测序正确后转入大肠杆菌BL21，优化诱导表达条件；纯化重组OmR40cl蛋白，并分析其与红细胞的凝集效果。结果：获得原核表达的OmR40cl蛋白，重组OmR40cl在低温(4qC)条件下可与兔血红细胞发生凝集作用。结论：原核表达体系适合水稻OmR40cl蛋白的融合表达。

[关键词]  水稻凝集素；OmR40cl；原核表达；凝集效果

[中图分类号]  Q78; R392.1[文章编号]  1009-0002( 2016) 02-0168-05

 凝集素是一类对红细胞具有凝集活性的蛋白或糖蛋白的总称，广泛分布于动物、植物和微生物中。自1884年Stillmark首次发现蓖麻凝集素以来…，已有多达1000多种植物凝集素被发现。植物凝集素是一类防御蛋白，在抗虫、抗真菌、抗细菌等方面扮演着非常重要的角色。转GNA（Galanthus n,ivalisagglutinin，雪莲花凝集素）阳和PTA（Pinellia ternataagglutinin，半夏凝集素）的水稻分别对白背飞虱和褐飞虱具有明显的毒杀作用；稻瘟菌抗病基因Pi~d2编码的蛋白是一个凝集素受体激酶；狗脊蕨凝集素分别对金黄色葡萄球菌、玉米大斑病菌、甘薯薯瘟病菌等具有很强的抑制作用。

 水稻中有125个凝集素基因和174个凝集素受体激酶基因。水稻凝集素在水稻胚胎发育、植株发育及抗病…I过程中可能扮演着非常重要的作用。目前，有关水稻凝集在水稻防御病原细菌中的研究报道较少。前期，我们通过2D DIGE-MS（荧光双向电泳一质谱技术）发现一个响应白叶枯病菌侵染的疣粒野生稻凝集素蛋白OmR40cl，与Ricin_B同源。在本研究中，我们将谷胱甘肽S转移酶( glutathi-one S-transferase，GST)与OmR40cl蛋白融合表达，利用GST层析法快速分离纯化OmR40cl-GST蛋白，通过体外红细胞凝集实验，验证OmR40cl是否具有凝集作用，为下一步研究OmR40cl的体外抑菌实验和有关OmR40cl是否参与水稻识别白叶枯病菌的侵染前期做准备。

1  材料与方法

1.1  材料

 原核表达菌株大肠杆菌BL21购自北京全式金生物科技有限公司；大肠杆菌DH5a由本实验室保存；原核表达载体pGEX-6p-l、填料和预装柱购自GE Healthcare Life Science公司；克隆载体pMD19-T Blunt Simple购自TaKaRa公司；高保真聚合酶KOD- FX购自TOYOBO公司；限制性内切酶购自NEB公司；T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；胶回收和质粒提取试剂盒购自康为世纪公司；SDS-PAGE所用化学试剂购白Amresco公司；蛋白分子量mark-er购自Fermentas公司；GST单克隆抗体购自Abmart公司；碱性磷酸酶标记二抗购自Sigma公司；PVDF购自Bio-Rad公司；半干转移槽购自Bio-Rad公司。

1.2  0mR40cl-GST融合表达载体的构建

 根据RGAP(Rice Genome Annotation Project,http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中公布的R40cl( Os03921040.2)的核苷酸序列，设计带有酶切位点的基因全长引物F-5 7（BamH I）GGATCCATGTTCGGCTTCGGGCACCAC3'和R-5 7(NotI)GCGGCCGCTTACCAGGGGACGATCTTCCA3，。  以本实验保存的pjET-OmR40cl为模板，在KOD-FX高保真聚合酶作用下进行PCR扩增（PCR反应流程：940C预变性2 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，68℃延伸90 s，共35个循环；68℃延伸8 min）。PCR产物经

1.5%琼脂糖凝胶电泳后回收并纯化得到OmR40cl片段，将其连接到pMD19-Tsb载体中，转化大肠杆菌DH5a，经菌液PCR检测为阳性后送博尚生物测序公司进行序列检测。

 将测序正确的pMD19- Tsb- R40cl和载体pGEX-6p-l分别用限制性内切酶Bam H I和Not I

酶切，经琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收，将回收片段和载体混合后，在T4DNA连接酶作用下于16℃反应3h，将连接产物导人大肠杆菌DH5a，菌液PCR检测阳性后测序，将测序正确的OmR40cl-GST质粒导人大肠杆菌BL21，菌液PCR检测为阳性的菌株作为下一步表达菌株。

1.3  融合蛋白的诱导表达

 挑取带有OmR40cl-GST的BL21单克隆于装有LB液体培养基（含100 μg/m L氨苄西林）的1.5 m LEP管中，37℃振荡过夜培养，按1:100的比例将菌液转接到5 m L（共6组）新鲜LB培养基（含100 μg/m L氨苄西林）中，37℃振荡培养2h至D600nm值约为0.6，

从菌液中取出1mL作为阴性对照组，在余下的菌液中添加IPTG（终浓度分别为0.1、0.4、0.7 m mol/L），并分别于37℃、30℃振荡培养5 h；从菌液中取1 m L作为实验组，8000 r/min离心3 miri收集菌体，向菌体中添加100μL缓冲液(50 m mol/L Tris- ClpH6.8，100 m mol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油）重悬菌体，然后在液氮中反复冻融3次，13 000 r/min离心10 min，转移上清液，再次用100μL缓冲液重悬沉淀，按比例向上清液和沉淀中添加

4×上样缓冲液，在沸水中孵育约10 min，13 000 r／min离心10 min，分别取10μL行12.5% SDS-PAGE及Western印迹。

1.4融合蛋白的纯化与鉴定

 按照1.3所述步骤大量诱导OmR40cl-GST蛋白表达，并用超声波细胞破碎仪破碎细胞，12 000 r／min离心20 min，转移上清液。在预装柱中纯化OmR40cl-GST蛋白：向预装柱的进料口缓慢注射8m L PBS缓冲液(140 m mol/L Na Cl，2.7 m mol/LKCl, 10 m mol/L NaZHP04, 1.8 m mol/L KH2P04,pH7.3)，吸取50 m L上清液，在鲁尔接头作用下缓慢经过预装柱，接着吸取10 m L PBS缓冲液缓慢清洗柱子，用洗脱缓冲液（50 m mol/L Tris-HCl，还原型谷胱甘肽，pH8.0）将柱内的OmR40cl-GST洗脱下来。将OmR40cl-GST蛋白溶液转移至透析袋中，并浸润在PBS缓冲液中透析4h，最后利用PEG20000去除样品中的水分，进行12.5% SDS-PAGE检测。

1.5融合蛋白的红细胞凝集实验

 采取兔子静脉处血浆10 m L，缓慢注入带有1m L柠檬酸钠(3.8%)的50 m L无菌EP中，向管中加4 m L生理盐水，水平轻微混匀，1500 r/min离心5 min；重复生理盐水清洗血红细胞共计5次；利用红细胞压积制成2%的红细胞悬浮液，分别向96孔板（5组×12梯度）中60个孔中各添加25μL生理盐水，将OmR40cl-GST蛋白溶液(1 mg/m L)按1/2梯度稀释，从第1孔一直添加到第12孔，GST(I mg/m L)、PHA（phytohemagglutinin，植物凝血素）(1 mg/

m L)及PBS溶液的添加方式与OmR40cl-GST基本一样，然后向每组的12个梯度中分别添加25 μL红细胞悬浮液，水平晃动后分别置于37℃及4℃约15min，观察凝集效果，计算凝集效价。

2结果

2.1  0mR40cl-GST融合表达载体的构建

 提取目的基因测序正确的pMD19-Tsb- R40cl质粒，用BamH I和NotI双酶切，获得OmR40cl片段。pGEX-6p-l原核表达载体也经同样双酶切处理，获得线性载体。将载体和目的片段连接后导人大肠杆菌DH5a细胞（图1），获得OmR40c1-GST重组质粒。提取目的基因，将测序正确的OmR40cl-GST质粒导人大肠杆菌BL21原核表达细胞，挑取菌液进行阳性检测（图2）。

2.2 0mR40cl-GST融合蛋白的诱导表达

 温度和IPTG浓度是影响融合蛋白表达的两大关键因素。为了确定融合蛋白OmR40cl-GST的诱导条件，重组菌株分别在2个温度( 37℃、30℃)和3个IPTG浓度(0.1、0.4、0.7 m mol/L)条件下进行诱导表达。结果表明（图3），IPTG浓度为0.1 m mol/L时OmR40cl- GST蛋白表达量最高，IPTG浓度为0.7m mol/L时蛋白表达量最低；温度基本不影响OmR40cl-GST融合蛋白的表达。

2.3  0mR40cl-GST融合蛋白的Western印迹验证

 OmR40Cl-GST融合蛋白表达载体通过小量诱导表达实验后，确定诱导条件为0.1 m mol/L IPTG、37℃下诱导表达5h。将诱导前后的菌液裂解后，提取上清蛋白进行Western印迹，结果如图4，空载体pGEX-6p-l诱导表达的M r为28.43x103的蛋白能被GST单抗特异识别，且与理论M r一致，说明该蛋白即为GST标签蛋白；pGEX-6p-l-OmR40cl诱导表达的M r为69.71x103的蛋白也能被GST单抗特异识别，且与理论M r一致，说明该蛋白即为OmR40cl-GST

融合蛋白。

2.4 0mR40cl-GST融合蛋白的纯化

 OmR40cl-GST融合蛋白通过适宜条件诱导表达后，将重组菌经超声波破碎及离心，获得上清液，通过亲和层析分别获得OmR40cl- GST和GST蛋白。为了检测亲和层析的洗脱情况，分别吸取15μL的第1、2及3个2 m L洗脱液进行SDS-PAGE检测，结果如图5，OmR40cl-GST和GST均被纯化，且第1管洗脱液的蛋白浓度最高。

2.5  0mR40cl-GST融合蛋白与红细胞的凝集作用

 将OmR40cl-GST、GST、PHA(浓度均为1 mg/m L)及PBS缓冲液分别与兔红细胞反应，结果如图6。在4℃时只有OmOmR40cl-GST和阳性对照PHA与兔红细胞有凝集沉降作用，而在37℃时只有PHA与兔红细胞有凝集沉降作用。可以看出OmR40cl具备凝集红细胞的功能，是一种水稻凝集素，并且其凝集效价随着温度的降低而增强。

3讨论

 凝集素在植物生长发育、抗盐、抗真菌及抗虫等生命活动中扮演重要的角色。自1936

年Sumner分离纯化了第一个植物凝集素ConA（刀豆凝集素）以来，对植物凝集素的性质、分子结构及功能的研究取得了很大进展。

 本研究中，我们采用原核表达体系诱导表达OmR40cl-CJST融合蛋白。为了最大量获得具有生物活性、可溶性的OmR40cl-GST，我们优化了诱导温度和IPTG浓度，使得OmR40cl-GST融合蛋白大量表达于细胞裂解后的上清里。我们利用亲和层析纯化OmR40cl-GST融合蛋白，经过洗脱、透析后，最终获得了纯度较高、特异性较强的OmR40cl-GST融合蛋白。

 用标签GST蛋白和OmR40cl-GST融合蛋白对兔红细胞进行凝集素血凝试验，发现OmR40cl在4℃下具有凝集红细胞的特性，而在37℃时丧失凝集作用。OmR40cl的凝集效价为0.125 mg/m L对应2%兔红细胞。对OmR40cl凝集素的表达与纯化，为研究OmR40cl的体外抑菌实验，以及OmR40cl是否参与水稻识别白叶枯病菌的侵染奠定了基础。