韩雍1，汪慧1，宋曦1，李响2，杨珺1
1．陇东学院农林科技学院(庆阳745000)；2．南京中医药大学第二临床医学院(南京210023)
摘要试验以酶联免疫吸附法为检测基础，在水相中合成发光量子点，再由量子点与磁性纳米材料相结合，形成磁性量子点，然后使磁性量子点与羊抗兔IgG联结制备生物荧光探针。该复合结构物质依靠磁性材料的磁富集作用，促进量子点聚集度，增强量子点荧光信号，利用新方法对目标物进行微量检测，有效地提高了分析测定的灵敏度和稳定性。试验以黄曲霉毒素B1为模式分析物，检测荧光强度与黄曲霉毒素B1质量浓度在0.1～1 000 n g/m L范围内成线性关系，检出限为0.1 n g/m L，取得了较满意的结果。
关键词量子点；磁颗粒；黄曲霉毒素B1;酶联免疫吸附法
食品安全是当今全世界共同关注的重大问题，近年来，由食品中各种生物毒素引起的食品安全问题已成为了各国防范和检测的重点。纳米技术( Nano-technology)是一种涉及领域较为广泛的现代科学和现代技术的结合物，其中以金纳米颗粒、量子点和核壳型荧光纳米颗粒为代表的纳米粒子在生物芯片、免疫检测分析、基因突变检测、遗传病、肿瘤诊断、药物研究、食品及环境中强致病性病原菌的检测等领域发挥着重要作用，其研究进展和研究成果引人注
目，这将是食品安全检测技术发展的重要方向。黄曲霉毒素B1是对人体伤害最严重的生物毒素，而黄曲霉毒素低量治病性，使粮食和食品安全难以进行检测控制，对其传统检测周期长、程序复杂和所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。纳米粒子结合生物检测能够对黄曲霉毒素进行高灵敏检测，但量子点荧光本身信号不稳定性使量子点生物检测具有不可靠特点，因此如何加强量子点荧光信号稳定性和信号强度是解决该问题的有效途径之一。
试验采用水相合成法制备巯基乙酸包裹的CdTe量子点，通过量子点与磁性纳米材料相结合，再利用磁性纳米材料的富集作用，提高荧光信号，并结合荧光分析方法，建立可靠的黄曲霉毒素Bi的新型高灵敏检测方法。
1试验材料
1.1材料与试剂
EDC、NHS: SigmaAldrich；羊抗兔-IgG:生工生物工程有限公司；硼氢化钠、Fe3O4、FeCl3.6H2O、乙二醇、1，6-己二胺等：国药集团上海化学试剂有限公司。
1.2主要仪器与设备
JEM2100透射电镜(TEM)：日本JEOL公司；RF5301荧光分光光度计：日本岛津；UV2300双光束紫外可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；傅里叶红外光谱仪：美国Bio-Rad公司；D8 advance型X射线衍射仪：德国布鲁克AXS公司；WH-3微型漩涡混合仪：上海沪粤明公司；HYG-Ⅱa回转式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊公司；TGL-16C离心机：上海安亭公司；DF-101S型集热式磁力加速搅拌器：河南巩义市予华公司；PYX-DH5-50隔水式电热恒温培养箱：浙江金坛市精达公司等。
2试验步骤
2.1磁性纳米粒子的制备与表征
磁性纳米颗粒（MNPs，Fe3O4约25 nm）制备：1，6-己二胺6.5 g，无水醋酸钠2.0 g，FeCI3. 6H2O 1.0 g，溶于30 m L乙二醇，保持50℃剧烈搅拌约1 h至溶液透明，溶液颜色渐变为酒红色后，转至高压反应釜，198℃条件下保持6h，停止反应并冷却至室温倒出。用水和乙醇超声冲洗3次，除去溶剂和未结合的1，6-己二胺，50℃干燥成粉末，保存待用。
2.2磁性纳米粒子与黄曲霉毒素Bi偶联抗原（AF Bl-BSA)的结合及表征
将2.1制成的MNPs 10 mg分散到5 m L的0.01 mol/L的PBS溶液中，并以超声波处理20 min，加入1.25 m L25%的戊二醛和100 mg的硼氢化钠，在室温下震荡1h，通过外部磁场将MNPs富集，用PBS缓冲液冲洗3次，去除未吸附的戊二醛。接着加入50斗L 1.4 mg/m L
的AFB．-BSA，并在室温下震荡6h，通过外部磁场收集反应产物，用PBS清洗3次。然后用5 m L 10 mg/m L的BSA溶液进行重悬，室温下保存6h，以封闭没有结合人工抗原的结合位点。通过外部磁场收集反应产物，并以5 m L 0.01 mol/L的PBS重悬，于4℃保存，待用。
2.3复合结构应用分析
对不同浓度的黄曲霉毒素B1进行荧光强度测定，与国标法进行对照，分析试验建立的检测方法的准确性和可靠性。同时，将检测到的荧光强度代入建立好的线性方程，计算回收率以评价该方法的稳定性。
3结果与讨论
3.1磁性纳米粒子的制备与表征
试验中制备的磁性纳米颗粒经超声波处理后可以在水中均匀分散，形成黑色的悬浊液（如图1A）。在外加磁场作用下，纳米颗粒可在2 min内实现聚集（如图1B），磁富集作用可以提高量子点分离的效率。
利用TEM和XRD对磁性纳米颗粒形貌和组成进行表征。由图2可知，制备的氨基化磁性纳米颗粒粒径在35～55 nm。由图3可知，该物质属尖晶石型Fe3O4磁性纳米颗粒，峰形符合JCPDS卡75-1610，其窄而强的衍射峰充分说明了磁性纳米颗粒具有良好的结晶性。
由图4可看出，585 cm-1处的强峰是Fe-O的振动峰。在制备Fe3O4纳米颗粒时引入了1，6-己二胺，在1 634 cm-1处为一级胺的N-H剪式振动吸收峰，834 cm-1和1040cm-1处为胺的N-H摇摆振动吸收峰，表明在制备Fe3O4的过程中，颗粒表面已经成功包覆了氨基。
3.2磁性纳米粒子和人工抗原AFB1-BSA的结合与表征
氨基化的磁性纳米粒子是通过戊二醛与人工抗原AFB1-BSA连接的，由于AFB1-BSA在280 nm以及360nm处有吸收，而磁性纳米粒子以及戊二醛在紫外光区没有吸收，所以可以用紫外分光光度计来验证两者是否已经结合。由图5所示，在波长280 nm和360 nm处，200μ L人工抗原AFB1-BSA原液紫外吸收和与磁性纳米材料结合富集后上清液紫外吸收相比较有一定差值，这说明有一部分的AFB1-BSA已经连接到了磁性纳米粒子上。同时，通过荧光显微镜对富集物质进行观察，也能够清晰看到磁性纳米材料的复合体均匀分散（见图6）。
对比氨基化磁性纳米粒子与结合人工抗原的磁性纳米粒子红外谱图（图7）发现，两曲线线型基本一致（在图4中也有同样表现），1 627 cm-1为一级胺的N-H剪式振动吸收峰，1 540 cm-1为二级胺的N-H吸收峰，可以解释为磁性纳米粒子连接人工抗原AFB1-BSA蛋白质一端的N-H吸收峰，表明磁性纳米粒子与人工抗原结合成功。
3.3复合结构应用性能分析
3.3.1 国标法对照测定
将不同质量浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液( 10-4，10-5，10-6，10-7, 10-8和10-9 g/m L)，分别用国标法和新方法对样品中黄曲霉毒素B1含量进行检测，对检测结果进行相关性分析，发现2种方法检测到的黄曲霉毒素B1质量浓度具有良好的相关性（如图8所示），线性方程为IF=0.903 7(AFB1)+0.651 1，R2=0.993 7，检测范围5～100 n g/m L，检出限为5 n g/m L。
在最佳的试验条件下，测量50 n g/m L标准黄曲霉毒素B1，不同稀释倍数下7次，以评估该方法的稳定性，荧光强度与黄曲霉毒素AFB1质量浓度在稀释倍数在1000内，即0.1～100 n g/m L下呈良好的线性关系（图9~图10）。回归方程为IF=-1.333 4(A FB1)+267.75（R2=0.993 6），得到的检出限为0．1ng/m L，相对标准偏差为3.0%。
3.3.2回收率测定
取市场上销售的大米，捣碎，加入不同稀释倍数的AFB1。稀释质量浓度为10-6～10-9 g/m L，测定荧光强度，并计算回收率。回收率如表1所示，回收率89.0%～96.77%，说明试验所建立的新型检测技术的灵敏度和准确性较高，可以用于实际样品中AFB1的检测。
4结论
试验制备的发光量子点球形纳米颗粒具有很好的分散性和均一性，荧光发射特征与量子点基本特征保持一致，光稳定性得到大幅度提高。量子点纳米颗粒与羊抗兔IgG结合制备荧光纳米探针，将人工抗原AFB1-BSA包被于磁性纳米材料Fe3O4颗粒上，利用磁性纳米材料的磁富集作用，能够增强荧光信号，使得荧光检测更加灵敏。制备的生物探针在最佳优化条件
下对黄曲霉毒素B1的检测具有高灵敏、高准确性、高可靠性，其检测限可达0.1 n g/m L。
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