鄱阳湖灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻的化感作用

 李林，  陈峰，  赵荣芳，

  （1．江西师范大学鄱阳湖湿地与流域研究教育部重点实验室，江西南昌330022;

 2．江西省水利规划设计院，江西南昌  330029）

 摘要：在室内控温、控光条件下，研究鄱阳湖洲滩优势植物灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻生长的影响。试验得到，灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻的抑制作用较高；枯灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻的抑制率在81‰88%，随浸泡液植物生物量含量的增加而增加，当浸泡液植物生物量含量大于24 g/L后对铜绿微囊藻抑制率差异较小；鲜灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻的抑制率大于90%，浸泡液植物生物量含量超过6 g/L时，对铜绿微囊藻抑制率差异较小；灰化苔草浸泡液巾化感物质使微囊藻细胞直径较对照组减小8%~12%，藻细胞发生固缩现象；微囊藻细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性在0.57—1.14 U/106 cell之间占对照组的30%~60%，藻细胞内氧化活性降低，胞内过氧化氢物不能及时去除在胞内积累，单位藻细胞丙二醛(MDA)增加3—4倍，藻细胞膜脂过氧化使藻细胞生长受到抑制。实验结果得到鄱阳湖洲滩优势植物灰化苔草在夏季将对蓝藻水华产生抑制作用，这为开发和利用鄱阳湖岸滩优势植物苔草生态控藻提供基础实验数据。

 关键词：灰化苔草；铜绿微囊藻；浸泡液；化感抑藻

 富营养化引起的蓝藻水华已成为全球性的环境问题，随着全球人口增加和需水量增加，蓝藻水华导致水体生物化学性质发生改变和水体功能下降。全世界平均约有59%的水华有毒，在我国大部分富营养化水体中蓝藻水华主要以铜绿微囊藻有优势藻种，对环境和社会经济造成巨大的经济损失，有效防止蓝藻水华发生是迫切需要解决的问题。蓝藻水华的治理方法主要包括物理、化学和生物等方法，容易产生二次污染，处理成本高，很难用于天然水体蓝藻水华的治理。Molich等提出植物化感抑藻，化感抑藻是一种新型的有效的控制蓝藻水华，植物化感抑藻具有绿色、低成本、化感物质容易获得、热稳定性高和无二次污染等优点，在应用上具有很好的发展前景。

 植物化感抑藻受到广泛的关注，研究人员开展了大量研究。Korner等研究沉水植物惠花狐尾藻的透析液作为培养基对藻类产生化感抑藻作用；Nakai等研究穗状狐尾藻对铜绿微囊藻的抑制作用，得到穗状狐尾藻培养液的过滤液对铜绿微囊藻的抑作用强于共培养下穗状狐尾藻对铜绿微囊藻的抑制作用；Chen等研究发现水生菰、东方香蒲、黄色鸢尾（黄菖蒲）、芦苇、芦竹、睡莲、莲花和空心链子草培养液对铜绿微囊藻产生抑制作用；水生莴苣（水芙蓉）和水剑叶的培养液对铜绿微囊藻产生抑制作用；陆生植物如稻草、小麦稿杆、稻壳和西藏去皮大麦等浸泡液均对铜绿微囊藻具有抑藻作用。Leao等研究发现颤藻分泌物对小球藻具有很强的抑制作用，而对卷曲纤维藻抑藻作用不明显，植物化感物质对藻类的抑制作用具有选择性。

 总结前人研究发现，对我国分布广泛，多生于沼泽、湖边以及湿地的灰化苔草化感抑藻研究鲜见报道。灰化苔草主要分布在湖滨低地，内湖、湖汊片状连续生长，面积达9.6万hm2，灰化苔草地上生物量为1 377—3 080 kg，hm2，鄱阳湖灰化苔草年产量数十万吨。本研究鄱阳湖洲滩灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻生长的影响，以期揭示鄱阳湖岸滩灰化苔草在夏季涨水期对蓝藻水华的作用，也为鄱阳湖洲滩灰化苔草对生态控制蓝藻水华提供实验数据。

1  材料与方法

1.1  实验材料

 蓝藻门的铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)购自中国科学院水生生物研究所。在500 mL锥形瓶中加入200 mL无菌培养基BG11，放置在光照培养箱中，保持温度在(29±0.1)℃，光照强度2 500 lx．光照周期为24:0，每天摇动3次，将处于对数生长期的藻种备用。

1.2  实验培养液

 鄱阳湖洲滩灰化苔草夹杂鲜苔草和枯苔草，本实验同时分别研究枯灰化苔草和鲜灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻的化感作用。取鄱阳湖洲滩灰化苔草，人工将枯灰化苔草和鲜灰化苔草分开，先人工清洗3次后超声波中清洗40 min，再使用蒸馏水清洗3次，自然晾干。枯灰化苔草和鲜灰化苔草分别剪为(2±0.2)cm小段，称重后分别浸泡在1500 mL锥形瓶中分别加1000 mL蒸馏水浸泡，本实验采用蒸馏水作为浸泡液，得到单位体积内苔草含量为0.12 g/mL。室内浸泡16 d后将浸泡液过0.45 p4m微孔滤膜，过滤液按一定比例添加改良后的BG11培养基，得到不同植物生物量的培养基，即为对照组0 g/L和试验组6、12、24、48和72 g/L，调整培养基中TN和TP浓度分别到2和0.2 mg/L，将配置好的培养液使用30 W紫外灯灭菌120 min后备用，以实现无菌培养基。

1.3  实验方法

  实验采用锥形瓶批式培养法，在250 mL锥形瓶中添加120 mL备用培养基，在光照培养箱中进行，控制温度(29±0.5)℃，光照强度2 500 lx，光暗比14 h：10 h．初始藻密度20xl04 cell/mL，每天人工摇动3次，再随机放置。培养装置使用30 W紫外灯杀菌2~4h，再进行培养实验；实验过程中严格无菌操作，实验过程每组设置3个平行样。

1.4  分析方法

 藻细胞计数采用血球板计数法计数，每隔ld在8:30从摇匀后的培养基中吸取l mL藻液至试管中，再取0.1 mL藻液在双面光学显微镜下计数，3次计数取平均值。使用连接显微镜软件拍相和图像分析测量细胞直径，采集藻细胞样本至少200 cell;采用改进的氮蓝四唑法对超氧化物歧化酶(SOD)活力测定；采用硫代巴比脱酸方法测定膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量；培养液TN、TP分别使用过硫酸钾氧化法和钼锑抗分光光度法。

 浸泡液对铜绿微囊藻的抑制率计算公式为：/R=(No-N)/Noxl00%，式中：IR为抑制率；N。为对照组中藻密度，N为实验组中藻密度。

2  结果与讨论

2.1  铜绿微囊藻的生长曲线

将枯灰化苔草和鲜灰化苔草不同生物量浸泡液作为培养基，将铜绿微囊藻密度随时间变化作图，如图1所示。从图l枯灰化苔草组中，试验组中铜绿微囊藻密度低于对照组中铜绿微囊藻密度，在培养过程中试验组铜绿微囊藻生物量先呈缓慢增加趋势再变缓；铜绿微囊藻密度随浸泡液生物量的增加而减少。

  从图1鲜灰化苔草组中可见，对照组中铜绿微囊藻密度远高于各试验组中铜绿微囊藻密度，试验组中铜绿微囊藻密度随浸泡液中灰化苔草含量的增加而降低，在6 g/L和12 g/L实验组中铜绿微囊藻有轻微的增加趋势，而在大于24 g/L灰化苔草生物量浸泡液培养基中铜绿微囊藻没有出现对数生长期，在培养第6天后开始降低。枯灰化苔草和鲜灰化苔草浸泡液作为培养基，均对铜绿微囊藻生长产生化感抑制作用，培养7d后试验组中微囊藻细胞开始发黄、死亡分解，灰化苔草浸泡液化感抑藻能力随浸泡液中灰化苔草生物量的增加而增加，出现剂量效应( Dose-re-sponse)，Korner等研究穗状狐尾藻的培养液对铜绿微囊藻的抑制试验也得到剂量效应。

2.2  灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻的抑制率

  选取第6天的枯灰化苔草和鲜灰化苔草浸泡液培养液中铜绿微囊藻密度，根据抑制率计算公式计算出铜绿微囊藻的抑制率绘图，如图2所示。从图2可以看出，鲜灰化苔草浸泡液培养基中铜绿微囊藻抑制率在93%—95%之间，鲜灰化苔草浸泡植物生物量在6—72 g/L之间时铜绿微囊藻抑制率差异较小(p>0.05)；枯灰化苔草浸泡液培养铜绿微囊藻的实验组中抑制率在81%—88%之间，枯灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻的抑制率随灰化苔草生物量的增加而增加，在枯灰化苔草生物量大于24 g/L的浸泡液对铜绿微囊藻抑制率差异较小；在各试验组中鲜灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻的抑制率较枯灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻的抑制率高，表明鲜灰化苔草和枯灰化苔草中均含有化感抑藻物质，水浸泡提取鲜灰化苔草中所含化感物质较枯灰化苔草更高。Su等使用稻草浸泡液培养基对铜绿微囊藻的抑制率在80%左右，潘琪等研究发现美人蕉种植水培养铜绿微囊藻20 d，对铜绿微囊藻的抑制率最高达64.4%，鄱阳湖洲滩优势植物灰化苔草具有较高的抑藻效果，可利用和开发鄱阳湖洲滩灰化苔草浸泡液抑藻特性，实现生态控制蓝藻水华的目的。灰化苔草浸泡液中释放的化感物质需进一步测定。

2.3  灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻细胞直径的影响

将第6天测得铜绿微囊藻细胞直径作图，如图3所示。从图3可以看出对照组中藻细胞直径大于试验组中藻细胞直径，试验组中细胞直径较对照组细胞直径缩短8%~12%；对照试验组中铜绿微囊藻细胞直径随浸泡液植物生物量增加呈减小趋势；鲜灰化苔草浸泡液中藻细胞直径较枯灰化苔草浸泡液中藻细胞直径小，鲜灰化苔草浸泡液与枯灰化苔草浸泡液中藻细胞直径无显著差异p>0.05）。化感物质可破坏细胞膜上巯基，降低膜完整性，从而致使胞内物质外流，细胞缩小，鲜灰化苔草和枯灰化苔草浸泡液中产生的化感物质，使铜绿微囊藻受到胁迫并使细胞固缩，从而引起细胞凋亡，并且随接触时间的延长，抑制铜绿微囊藻细胞的生长，在藓苔草浸泡液中出现藻细胞死亡现象，Zhang等在研究蛋白核小球藻与铜绿微囊藻的相互作用时，得到相似的结论。

2.4  灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响

将第3天测的铜绿微囊藻超氧化物歧化酶活性作图，如图4所示。从图4可以看出对照组中铜绿微囊藻细胞SOD活性较试验组中藻细胞SOD活性高，试验组中藻细胞SOD活性降低，约占对照组细胞活性的0.3～0.57；各试验组中藻细胞SOD活性随浸泡液植物生物含量的增加而降低，鲜灰化苔草浸泡液中藻细胞SOD活性在0.57—0.8 U/106 cell之间，枯灰化苔草浸出液中细胞SOD活性在0.67—1.14 U/106 cell之间，鲜灰化苔草浸泡液中藻细胞SOD活性较枯灰化苔草中藻细胞SOD活性更低。

 化感物质主要是破坏藻细胞结构，改变藻的光合作用，呼吸和酶活性等对藻类产生抑制作用，藻细胞受到灰化苔草浸泡液化感物质胁迫时，藻细胞内活性氧大量积累使藻细胞体内SOD活性降低，使藻细胞体内超氧阴离子不能及时清除，大量积累，不能有效防御活性氧或其它过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而自由基对藻细胞有机体产生毒害。

2.5  灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻丙二醛(MDA)含量的影响

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可指示细胞内反应氧簇的多少和膜脂过氧化水平的高低，可作为细胞膜机构损伤，藻体受胁迫程度的一种标志。将第6天鲜灰化苔草和枯灰化苔草浸泡液中铜绿微囊藻膜脂过氧化含量作图，见图5。

 从图5可以看出在鲜灰化苔草和枯灰化苔草浸泡液的作用下，单位细胞内丙二醛(MDA)含量均随枯灰化苔草和鲜灰化苔草浸泡液生物含量的增加而增加，变化趋势相似；Zhang等研究黄连对铜绿微囊藻化感抑制作用，发现藻细胞内丙二醛积累使铜绿微囊藻氧化破坏而产生抑制作用；再力花根系分泌物、菖蒲和枯草等对铜绿微囊藻的化感抑制作用具有相似的作用。鲜灰化苔草和枯灰化苔草浸泡液试验组中单位细胞MDA含量是对照组3到4倍多，说明枯灰化苔草和鲜灰化苔草浸泡液含有化感物质，使藻细胞内活性氧积累，细胞膜脂过氧化，从而抑制铜绿微囊藻生长。

3  结论

 (1)通过室内试验首次得到，鄱阳湖洲滩优势植物枯灰化苔草和鲜灰化苔草浸泡液，均对铜绿微囊藻产生化感抑制作用；培养6d后灰化苔草浸泡生物量在6 g/L时，鲜灰化苔草和枯灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻的抑制率大于80%。

 (2)铜绿微囊藻细胞在灰化苔草浸泡液长时间作用下，藻细胞直径降低产生固缩现象，同时藻细胞体内超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，细胞内丙二醛(MDA)含量增加；灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻细胞产生固缩，胞内过氧化物的积累，对铜绿微囊藻产生抑制作用。

 (3)鄱阳湖洲滩灰化苔草在涨水淹没将对蓝藻水华产生抑制作用，并为开发鄱阳湖洲滩灰化苔草在生态控藻中技术提供实验数据。需进一步检测苔草浸泡液化感抑藻物质。