枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备抗氧化多肽工艺

 柯旭清

 贵州轻工职业技术学院(贵阳550025)

摘要  以豆粕为原料，研究枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备抗氧化多肽的工艺。通过响应面分析法确定枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备抗氧化多肽的最佳工艺条件为：接种量3.4%、pH 7.6、发酵温度35.4℃和发酵时间82.1 h。制备出来的抗氧化多肽具有较强的还原能力，高于对照组VC，且具有较强清除OH．的能力，随着浓度的增加，抗氧化多肽对OH．的清除能力逐渐提高，明显高于对照组VC。

关键词豆粕；发酵；抗氧化多肽；响应面

    豆粕是大豆榨取豆油后的副产物，一般只用于饲料或者肥料中，利用价值比较低。但是豆粕中含有丰富蛋白质等营养物质，蛋白经过发酵、酶解可制备抗氧化多肽。抗氧化多肽具有清除自由基、抗衰老和抗疾病等功能。通过豆粕制备抗氧化多肽，可提高豆粕利用率和商业价值。因此，利用响应面分析法对枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备抗氧化多肽的工艺条件进行优化，并研究得到的抗氧化多肽的抗氧化活性，以期为豆粕资源的综合开发利用提供理论参考。

1材料及方法

1.1原料与试剂

  豆粕：购于当地油脂有限责任公司；枯草芽孢杆菌、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、乙醇、盐酸溶液、磷酸钠缓冲溶液、铁氰化钾溶液、三氯乙酸、FeCl3溶液、邻二氮菲溶液、VC等：实验室提供；DPPH:广州新晖生物科技有限公司；Dl01大孔吸附树脂、超滤膜、G-75葡聚糖凝胶：广州天益化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

  DS-1电动组织捣碎机：惠州新光仪器有限公司；UV-4802双光束紫外可见分光光度计：广州尼维仪器有限公司；GT10-1高速离心机：广州柏斯特仪器有限公司；真空冷冻干燥机：深圳启博仪器有限公司；高压灭菌锅：东莞信惠科技有限公司；超净工作台：惠州新光仪器有限公司；超滤设备：广州柏斯特仪器有限公司等。

1.3试验方法

1.3.1枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备抗氧化多肽工艺流程

1.3.1.1抗氧化多肽粗品的制备工艺流程

1.3.1.2抗氧化多肽的分离纯化工艺流程

1.3.2枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备抗氧化多肽条件的优化

  通过单因素试验考察接种量、pH、发酵温度和发酵时间对枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备抗氧化多肽效果的影响，在选取各因素的最优试验范围，采用响应面分析法对制备抗氧化多肽条件进行优化。

1.3.3  DPPH．清除率的测定

  取上述抗氧化多肽溶液1.0 m L和5 m L 100 μmol/L的DPPH．溶液加到同一试管，摇匀，黑暗中静置30mm，测其吸光度。

1.3.4分离纯化后的抗氧化多肽还原力的测定

    采用普鲁士蓝法测定。

    取5.0 m L 3.0 mg/m L的上述抗氧化多肽溶液，加入3.0 m L pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液和5.0 m L 3.0%铁氰化钾溶液，保温30 min后，加入5.0 m L 15.0% TCA溶液，混匀，离心。取上清液，加1.0 m L 0.2% FeCl3溶液，定容，700 nm波长处测吸光度。

1.3.5分离纯化后的抗氧化多肽羟自由基(OH．)清除能力的测定

    采用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定。

2结果与分析

2.1  枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备抗氧化多肽条件的优化

2.1.1接种量对抗氧化多肽制备效果的影响

    设定pH为8，发酵温度为35℃，发酵时间为80 h，分别在接种量为1.5%，2.5%，3.5%，4.5%，5.5%和6.5%六个梯度下，按照1.3.1和1.3.3的方法制备抗氧化多肽并且测其DPPH．清除率。由图1可以看出，接种量为3.5%时，抗氧化多肽制备效果较好。

2.1.2 pH对抗氧化多肽制备效果的影响

    设定接种量为3.5%，发酵温度为35℃，发酵时间为80 h，分别在pH为5，6，7，8，9和10六个梯度下，按照1.3.1和1.3.3的方法制备抗氧化多肽并且测其DPPH．清除率。由图2可以看出，pH为8时，抗氧化多肽制备效果较好。

2.1.3发酵温度对抗氧化多肽制备效果的影响    

设定接种量为3.5%，pH为8，发酵时间为80 h，分别在发酵温度为29℃，31 ℃，33 ℃，35 ℃．37 ℃和39℃六个梯度下，按照1.3.1和1.3.3的方法制备抗氧化多肽，并测其制备率。由图3可以看出，发酵温度为35℃时，抗氧化多肽制备效果较好。

2.1.4发酵时间对抗氧化多肽制备效果的影响

    设定接种量为3.5%，pH为8，发酵温度为35 ℃，分别在发酵时间为55，65，75，85，95和105h六个梯度下，按照1.3.1和1.3.3的方法制备抗氧化多肽并且测其DPPH．清除率。由图4可以看出，发酵时间为85 h时，抗氧化多肽制备效果较好。

2.1.5制备抗氧化多肽的优化试验

    结合单因素试验的结果，分别接种量为2.5%，3.5%和4.5%，选取pH为7，8和9，发酵温度为33℃，35℃和37℃，发酵时间为75，85和95 h，利用响应面分析法优化抗氧化多肽制备最佳工艺参数。因素水平见表1，结果见表2。

    对抗氧化多肽制备进行分析，接种量、pH、发酵温度和发酵时间都是显著因素。关于抗氧化多肽的DPPH．清除率二次回归拟合方程：

    由表3可以看出，模型的p<0.000 1，而失拟项的p=0.836 5，说明了抗氧化多肽制备的模型与实际情况拟合程度比较好，可以预测抗氧化多肽制备的条件。    

由方差分析结果可以看出，AB的交互作用、AC的交互作用、AD的交互作用、BC的交互作用、BD的交互作用以及CD的交互作用都显著。根据抗氧化多肽制备试验结果和回归方程各项的方差分析，由响应面分析法优化出抗氧化多肽制备最佳工艺条件为：接种量3.4%、pH 7.6、发酵温度35.4 ℃和发酵时间82.1 h。

2.2抗氧化多肽抗氧化活性研究

2.2.1豆粕制备的抗氧化多肽还原力测定

  由图5可以看出，随着枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备的抗氧化多肽质量浓度增加，吸光度不断增大，相应地还原力也依次增强。当质量浓度>0.9 mg/m L，吸光度与对照组VC差异显著，明显地高于对照组VC的吸光度。表明枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备的抗氧化多肽具有较强的还原能力

2.2.2豆粕制备的抗氧化多肽羟自由基(OH．)清除能力测定

  由图6可以看出，在试验质量浓度范围内，随着枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备的抗氧化多肽质量浓度增加，OH．清除率明显提高，之后OH．清除率依次增大，最后趋向平缓。当枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备的抗氧化多肽质量浓度大于0.6 mg/m L时，相对于对照组VC，枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备的抗氧化多肽对OH．清除率较大。而且，在质量浓度为1.8 mg/m L时，抗氧化多肽显示出对OH．最强的抗氧化性，达到8 8.5%。表明枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备的抗氧化多肽是一种良好电子供体，具有较强清除OH．的能力。

3结论

    枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备抗氧化多肽的最佳工艺条件为：接种量为3.4%、pH 7.6、发酵温度35.4℃和发酵时间82.1 h。

    枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备得到的抗氧化多肽具有较强的还原能力和较强清除OH．能力，高于对照组VC，而且随着抗氧化多肽质量浓度的增加，其还原能力和清除OH．能力也逐渐增强。因此，枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备得到的抗氧化多肽具有较好抗氧化活性。