红茶、绿茶和普洱熟茶体外抗氧化作用比较研究

 王昱筱，周才琼*

 西南大学食品科学学院（重庆400715）

摘要  以3种不同类型茶叶——绿茶、红茶和普洱熟茶为材料，按照不同饮茶习惯，采用不同冲泡浓度茶汤进行体外抗氧化作用比较研究，并测定了3种荼样主要滋味品质成分含量及荼多酚（含黄酮类）冲泡溶出量。结果表明，绿茶水浸出物、多酚、游离氨基酸和可溶性总糖均高于红茶和普洱熟茶，3种茶叶体外抗氧化活性均随冲泡浓度增加而略有下降，在试验冲泡浓度范围内，绿茶有较强清除DPPH自由基的能力，红茶有较强的羟自由基清除能力，普洱熟茶清除超氧阴离子自由基能力较强；相关分析显示,O2-．清除率与多酚、黄酮溶出量显著负相关(p<0.01)，而DPPH.和.OH清除率与茶多酚、黄酮溶出量无关(p>0.05)，不同茶类多酚和黄酮类溶出量与O2-．清除率、DPPH.和.OH清除率呈负相关(p<0.05)。结果表明不同茶类体外抗氧化作用不同，一般饮茶浓度范围内,3种茶叶均具有较好的体外抗氧化作用，以饮用淡茶为宜，选择和饮用不同种类的茶叶可能带来更好的健康效应。

关键词  茶叶；不同发酵方式；冲泡浓度；多酚类；体外抗氧化活性

 茶叶是世界三大天然饮料之一，以其独特的色、香、味而成为世界性的饮料。茶叶富有营养价值和药效作用，饮茶有益于人体健康和长寿。根据制造方法和茶多酚氧化程度，可分为绿茶、白茶、黄茶、青茶、红茶和黑茶六大类。其中，绿茶属于不发酵茶，红茶属于全酵茶，而普洱茶属于后发酵茶。茶叶中的化合物有500多种，其中最主要的滋味成分和功能成分是多酚类物质。有大量研究显示茶多酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗过敏及抑菌抗病毒等多种药效。但茶叶多酚组成复杂，包括简单酚和类黄酮类，后者约占多酚总量的90%，有儿茶素、花白素、黄酮类、黄酮醇类及花青素等。不同加工方式可导致茶多酚发生不同程度的氧化，并形成相对分子质量较大的酚类氧化产物，如茶黄素、茶红素及茶褐素，可导致其功能特性，特别是抗氧化性质发生改变。因此，试验选择不发酵茶（绿茶）、全发酵茶（红茶）和后发酵茶（普洱熟茶）作为试验材料，对不同冲泡浓度下茶汤抗氧化活性的变化进行比较研究，并分析其与茶多酚及黄酮溶出量相关性，以指导科学饮茶。

1  材料与方法

1.1试验材料

 罗村红茶、叙府绿茶、云南大益七子饼普洱茶（熟茶）：由西南大学实验茶厂提供。

1.2主要试剂与仪器设备

 自由基DPPH:梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；芦丁：中国食品药品检定研究院。其他试剂均为市售分析纯级。

  722可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；FA2004A分析天秤（感量0.000 1）：上海精天电子仪器厂；HH-6数显恒温水浴锅：金坛市富华仪器有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1茶叶基本成分

 干物质含量：GB/T 8303-2013;水分：GB／T 8304-2013；水浸出物：GB/T 8305-2013;咖啡碱：CB/T 8312-2013;茶多酚：GB/T 8313-2008：游离氨基酸总量：GB/T 8314-2013;可溶性总糖：中国名茶可溶性总糖的含量研究。

1.3.2茶汤主要抗氧化成分

 茶汤制备：料液比1：150，1.5：150，2：150,3：150和4：150( g/m L)，沸水冲泡5 min，过滤，取茶汤得测试样品液。

 总黄酮溶出量：三氯化铝法测定。参考何书美等的方法，有所修改。分别取不同料液比茶汤1 m L于25 m L比色管中，加入1.5% AICI3 8 m L和醋酸一醋酸钠的缓冲液( pH 5.5)4 m L，并用500/0乙醇定容至刻度，摇匀，静置0.5 h，于415 nm测试反应液吸光度。以芦丁标准物绘制标准曲线(8，12，16，20,24和28μ g/m L)。重复3次，结果以芦丁当量(Rutin

 equivalents，RE)表示，单位为mg RE/g。茶多酚溶出量：采用GB/T 8313-2008，

1.3.3体外抗氧化作用分析

1.3.3.1  清除DPPH自由基

  DPPH法采用Bondet等的方法。试验需将反应液摇匀，室温下避光静置30 min后于517 nm处测定对照组（A s）、样品组（A i）和样品空白组（A j）的吸光度，按公式(1)计算其清除率。

1.3.3.2清除超氧阴离子自由基

 取9 m L磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH 8.20)与1 m L样品液混合，放置于25℃恒温水浴中15 min。取出混匀，冷却后取3 m L混合液于试管中，加入0.1m L的邻苯三酚溶液(45 m mol/L)，摇匀，在第4分钟时加入1滴盐酸溶液( 10 mol/L)终止反应，测定其在325 nm处的吸光度（A1），同时分别测定没有加邻苯三酚溶液的样品液和磷酸盐混合液的吸光度（A2）和以1 m L蒸馏水替代样品液的磷酸盐和邻苯三酚混合液的吸光度（A2），同样的方法重复3次。清除率按照公式(2)进行计算。

  A1:9 m L pH 8的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液+1 m L试样+0.1 m L 45 m mol/L邻苯三酚溶液+1 m L 10 m mol/LHC1吸光度；A2：9 m L pH 8的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液+1 m L试样+10 m mol/L HC1吸光度；A3：9 m L pH8的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液+1 m L蒸馏水（无水乙醇，无水甲醇）+0.1 m L 45 m mol/L邻苯三酚溶液+1 m L 10 m mol/L HCI吸光度。

1.3.3.3清除羟基自由基

 依据Fenton反应测定。在反应体系中分别加入：1 m L 9 m mol/L FeS04、1 m L 9 m mol/L水杨酸一乙醇和不同料液比茶汤1 m L。加入H2O2启动反应，37 0C反应0.5 h，以蒸馏水为参比，在波长510 nm处测定各茶汤的吸光度。考虑到茶汤本身的吸光度，以1 m L 9 m mol/L FeS04、1 m L 9 m mol/L水杨酸一乙醇、1 m L不同料液比茶汤和1 m L蒸馏水作为茶汤的本底吸光度。清除率计算公式：

1.4统计学分析

 试验数据以x±SD表示，采用Microsoft Excel 2010作图，用SPSS 17．0软件进行LSD多重比较法、相关性分析和f检验（正态分布数据）进行数据统计。p<0.05表示具有统计学意义。

2结果与分析

2.1茶叶基本成分

 经对红茶、绿茶和普洱茶基本成分进行分析，试验结果见表1。水浸出物、茶多酚、可溶性总糖和游离氨基酸均以绿茶较高，红茶和普洱茶较低。这与茶鲜叶发酵方式和发酵程度有关。可能是绿茶鲜叶中内含物受氧化程度最小，在制茶过程中因氧化消耗小有关。红茶和普洱茶由于全发酵和后发酵作用，其茶多酚含量相对较低，但同时多酚类的氧化又形成了茶黄素等其他高分子物质。咖啡碱含量则以红茶和普洱茶相对较高。

2.2 3种茶叶体外抗氧化作用比较分析

2.2.1  清除DPPH自由基作用

 3种茶叶清除DPPH自由基结果如图1，随冲泡浓度增加，DPPH自由基清除率缓慢下降，在较低冲泡浓度下，3种不同发酵方式茶叶均具有更高的DPPH清除能力。在试验冲泡浓度内，绿茶、红茶和普洱熟茶DPPH自由基清除率分别为84.06%—91.40%，54.06%～82.4%以及68.19%～80.32%。其中，绿茶清除能力最强，红茶和普洱茶清除率相当。表明发酵导致的多酚含量下降和不同的发酵方式可能形成不同聚合度的酚类多聚物均可影响其DPPH自由基清除能力。

2.2.2清除超氧阴离子自由基作用

 3种茶叶不同冲泡浓度茶汤清除O2-·试验结果如图2，随冲泡浓度增加，O2-·清除率呈下降趋势，其中，绿茶随冲泡浓度增加，清除能力逐渐下降，红茶和普洱熟茶则出现下降后保持稳定或略回升态势，表明发酵可能通过影响茶叶多酚的组成而影响其抗氧化能力。在试验冲泡浓度内，绿茶、红茶和普洱熟茶O2-·的清除率分别为56.77%～90.12%，61.01%～85.09%以及81.73%—96.98%，其中普洱熟茶清除能力最强。

2.2.3清除羟基自由基功能作用

  3种茶叶不同冲泡浓度茶汤清除羟基自由基结果如图3，随冲泡浓度增加，羟自由基清除率呈逐渐下降趋势。在试验冲泡浓度内，绿茶、红茶和普洱熟茶对羟自由基的清除率分别为34.33%～68.96%，59.87%～76.41%以及25.66%～51.16%，其中，红茶汤清除能力最强，其峰值清除率料液比为2：150(g／m L)。

2.3茶汤主要抗氧化成分及与抗氧化作用相关分析

2.3.1 3种茶叶主要抗氧化成分冲泡溶出量分析

 3种茶叶茶汤主要抗氧化成分多酚和黄酮类溶出量随冲泡料液比变化如图4~图5所示，3种茶叶总体茶多酚溶出量绿茶>红茶>普洱茶，绿茶与普洱茶的茶多酚溶出量大致趋势都随料液比的增加而降低，这与陈正函报道一致。黄酮物质具有清除体内自由基、防癌、预防心血管疾病、除臭等生物活性功能，3类茶叶黄酮溶出量绿茶>红茶>普洱茶，这与茶多酚有相似性，但随着料液比增加，黄酮溶出量的变化趋势与茶多酚变化趋势无关(p>0.05)，其中红茶和普洱茶都在料液比为1.5：150( g/m L)时黄酮溶出量显著升高。

2.3.2 3种茶叶体外抗氧化活性与抗氧化成分含量相关性分析

 对3种茶叶不同冲泡浓度下多酚及黄酮溶出量及与体外抗氧化作用进行相关分析，结果如表2，绿茶、红茶和普洱熟茶DPPH自由基清除率与茶汤多酚量显著负相关(p<0.05)；绿茶O2-·和．OH清除率与茶多酚溶出量显著负相关(p<0.05)。绿茶O2-清除率、．OH清除率与黄酮溶出量显著负相关(p<0.05)；红茶DPPH自由基清除率与黄酮量显著负相关(p<0.01)。表明在同类茶叶中，提高冲泡浓度并不会提高其体外抗氧化活性。

2.3.3多酚和黄酮类溶出量与其茶叶体外抗氧化相关性分析

  经对不同茶样茶汤茶多酚及黄酮溶出量及与体外抗氧化作用进行相关分析，结果如表3。O2-·清除率与茶多酚、黄酮溶出量显著负相关(p<0.01)。DPPH．和．OH清除率与茶多酚、黄酮溶出量无关(p>0.05)。表明茶的体外抗氧化作用受茶汤体系中多酚及多酚氧化产物以及其他相关成分的影响，不同茶类不能用多酚含量来推测其体外抗氧化作用。

3结论与讨论

  试验以日常消费频率较高和加工工艺有较大差异的3种茶叶——绿茶、红茶和普洱熟茶为研究对象，分析了三种茶叶一般滋味品质成分，显示不发酵茶绿茶水浸出物、茶多酚、游离氨基酸和黄酮类均最高，全发酵茶（红茶）和后发酵茶（普洱熟茶）因为发酵氧化作用，各种滋味品质成分相对较低。经对3种茶叶在一般冲饮浓度下主要抗氧化成分多酚和黄酮类溶

出量及相应体外抗氧化活性进行分析显示，三种茶叶体外抗氧化作用均随著冲泡浓度增加而略有下降，其中，绿茶有较强的DPPH自由基清除作用，普洱熟茶有较强的O2-·清除能力，红茶对羟自由基的清除最强。分别对3种茶叶多酚和黄酮类溶出量与其体外抗氧化作用进行相关分析显示，茶叶主要抗氧化成分多酚和黄酮类含量与其体外抗氧化作用呈负相关(p<0.05)，经对茶汤中多酚和黄酮类含量与其体外抗氧化活性进行相关分析显示茶汤多酚、黄酮溶出量与DPPH．和．OH清除率无关(p>0.05)，与O2-·清除率显著负相关(p<0.01)。

 试验研究结果表明在同类茶叶中多酚含量提高并不能提升其体外抗氧化作用，不同种类茶叶中多酚和黄酮类含量与其体外抗氧化活性无关。这可能与茶叶多酚构成及发酵方式有关，茶叶多酚是以儿茶素为主体非30余种酚类化合物的总称，其酸性酚羟基具有很强的提供质子氢的能力，可捕获自由基使连锁反应中断。但多酚在提供活泼氢质子捕获自由基的同时，本身被氧化产生过氧化物自由基的副反应，同时，多酚的氧化产物邻醌是一类强氧化剂。所以，在一定浓度范围内多酚具有很强的抗氧化能力，高于一定浓度后，清除能力下降，助氧化作用增强。试验结果也与多酚抗氧化和助氧化特性吻合。表明在一般饮茶浓度范围内饮用淡茶更好，提高饮茶浓度并不能相应提升体外抗氧化作用，同时由于不同的加工方式导致茶多酚及相关抗氧化成分发生氧化，从而影响其对不同自由基的清除效果，因此，选择和饮用不同种类的茶叶可能带来更好的健康效应。