焦扬， 罗学刚， 唐永金， 贾文甫， 李波
（1．西南科技大学生命科学与工程学院；
2．西南科技大学核废物与环境安全国防重点学科实验室，四川绵阳621010；
3．生物质材料教育部工程研究中心，四川绵阳621010）
摘要：通过盆栽实验，研究不同铀浓度(0、25、50、100、250、500 mg/kg)下，铀对3种植物（反枝苋、鬼针草、印度芥菜）的根际土壤酶（脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶和脱氢酶）活性的影响。结果表明：铀对不同酶活均有抑制作用；脱氢酶、酸性磷酸酶和脲酶与铀浓度呈显著负相关，可以作为监测铀污染的酶学指标，其中脱氢酶最高显著性可达到-0.974，对铀最为敏感。3种植物均能提高土壤酶活性，但不同植物对不同土壤酶影响不同：反枝苋对酸性磷酸酶的提升效果最强，对脱氢酶保护作用最强；鬼针草对蔗糖酶提升效果最强，对脲酶的保护作用最强；印度芥菜对脲酶和脱氢酶提升效果最强，对酸性磷酸酶和蔗糖酶保护效果最强。3种植物对不同酶活均值对比发现：反枝苋组巾平均抑制率最低为l1.690/,，平均变化率为21.579fl/0，对铀污染土壤酶活修复效果最好。
关键词：铀污染；土壤酶；酶学指标；酶活修复
20世纪30年代发核裂变现象被发现以来，随着对核能研究的深入，大量的铀矿被开采和冶炼，因此大量的土壤和水体被铀尾矿和废料污染。铀作为环境中毒性较强的重金属之一，除具有化学毒性外，还具有衰变放射性毒性的特性。铀发射射线主要是a射线(铀-235为4.679 MeV，铀-238为4.270 MeV)12]而铀离子主要通过食物链以气溶胶的形式进入人体，长期处于被铀污染的环境中的人更易患癌。有报道称，在一些铀冶炼区附近土壤的铀浓度高达几十到几百mg/kg，因此对其修复势在必行。
在众多修复方法中，植物修复以其修复价格低廉、易于实施、对环境扰动少和无二次污染等优点，迅速在重金属污染治理方面受到重视。目前国内外关于铀污染土壤的植物修复研究上进行了广泛的研究并取得了显著成果，但其主要研究集中于富集植物的筛选上，而对修复后的土壤环境监测、评价方法的研究较少。
土壤酶作为土壤中生物化学反应的催化剂，在土壤肥力评价、植物营养利用效率以及土壤污染消除等方面起着重要作用。相关研究发现，土壤酶活性与重金属污染程度存在一定的相关性，因此，土壤酶活性可以用来判别土壤重金属污染程度。同时研究发现种植植物对土壤酶活有修复作用。因此研究植物根际土壤酶活的变化对于探索富集植物修复土壤污染的效果和机理有重要作用。但放射性核素铀污染对富集植物根际土壤酶活的影响的研究还鲜有报道，值得深入研究。
因此，本研究选取普通植物反枝苋、某铀尾矿优势植物鬼针草、重金属修复模式植物印度芥菜为材料，通过盆栽控制性实验，添加外源铀的方法，对比铀污染对不同植物的根际土壤酶活性的影响，探讨不同植物对土壤酶活的作用，以期为监测土壤铀污染状况和评价土壤修复效果提供生物酶学理论依据。
1材料与方法
1.1材料
供试植物：苋科苋属反枝苋(Amaranthus retrojlexus)、十菊科鬼针草属鬼针（Bidens pilosa L）和字花科芸薹属印度芥菜（Brassica juncea），植物种子采于某铀尾矿库。
供试土壤为西南科技大学水稻试验田中表层土壤(0—20 cm)。该土壤pH值为6.02，有机质含量为23.9 g/kg，全氮1.61 g/kg，碱解氮93.8 mg/kg，全磷0.858 g/kg，有效磷25 mgfkg，全钾21.3 g/kg，速效钾135 mgfkg，阳离子代换量14.6 cmol/kg，pH 6.02，土壤采回风干过5 mm筛充分混匀备用。
本实验在西南科技大学温室中进行，采用15 cmx20 cm的规格一致塑料米氏盆，每盆装入干重1kg土壤，以不同浓度U02(CH3C00)2-2H20溶液为添加物，将其在温室中稳定2个月后再进行两次深翻，确保U分布均匀。不同浓度添加物与土壤结合之后每盆土壤中的U含量（以纯U计）分别为CK(O)、U1(25)、U2( 50)、U3(100)、U4(250)、U5(500)，括号内为含量，单位为mg/kg，每个处理均设3个重复。然后直播3种植物的种子，出苗后每盆定苗2株，另设一组不种植植物的空白对照。实验期间保持土壤含水量为80%。
1.2取样与测定
培养80 d后，将植物从盆中连根完全取出，用抖落法收集根际土壤，同时分别取无植物的处理，装入无菌纸袋。待自然风干后与实验室条件下过100目筛，除去土壤样品中的杂质，制成实验样品。测定土样中的4种酶（脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶、脱氢酶）的活性。
土壤酶酶活性的测定方法参照关松荫的方法。脲酶采取苯酚钠一次氯酸钠比色法，活性单位以产生的NH3-N的量表示；酸性磷酸酶采用对硝基苯比色法，活性单位以产生的对硝基苯酚的量表示；蔗糖酶采用3，5-=硝基水杨酸比色法，活性单位以产生的葡萄糖的量表示；脱氢酶采用TTC(氯化三苯基四氮唑)还原比色法，活性单位以产生的TTF(2，3，5-三苯基甲月替)的量表示。重复测定3次，其中每种酶的测定均包含无底物和无土壤的处理。
1.3数据分析
相对变化率(R，)%=(植物组土壤酶活性一空白组土壤酶活性)xl00/空白组土壤酶活性，均为相同浓度处理下。用来表示不同植物对根际土壤酶活的影响。
抑制率%一（不同处理浓度下土壤酶活一未添加铀的土壤酶活）xl00/未添加铀的土壤酶活，均为同一中植物。用来表示不同浓度铀污染对某一植物的根际土壤酶活的影响。
采用Excel 2007进行数据处理，用DPS 7.5进行多重比较和显著性分析，用SPSS 19.0进行显著性分析，用Origin 8.5作图。
2结果与分析
2.1铀对3种植物根际脲酶酶活性的影响
土壤脲酶可以催化尿素的水解生成氨，能够来表征土壤中氮的转化状况。实验结果如图1所示，除鬼针草组外，其他3组处理变化趋势类似，U1能显著促进土壤脲酶的活性，U2对酶活影响不显著，U3、U4、U5对脲酶活性呈现显著抑制作用，且抑制率随着铀浓度的上升也逐渐升高；而鬼针草组U1、U2、U3对脲酶活性作用不显著，U4、U5显著抑制脲酶活性。总的来看，铀对土壤脲酶有“低促高抑”的现象，陈苏等研究铅对土壤酶活的影响中也发现了类似的现象。这说明铀对土壤脲酶具有与其他重金属类似的影响：低浓度的金属离子作为酶的辅基能促进酶活性中心与底物间的酶蛋白的表面电荷结合，从而增强酶活性；同时高浓度的金属离子能够抑制土壤中微生物的生长和繁殖，减少微生物体内酶的合成和分泌，因此酶活性降低，也可能作用于植物根系使根系分泌物减少直接或间接导致土壤酶活的降低。
对比分析如表1所示，相关系数表明，除反枝苋组外，土壤脲酶活性与铀浓度相关系数均达到显著相关或极显著负相关，这说明土壤脲酶能表征铀的污染状况，可作为评价铀污染的指标，这与张飞等对铀与土壤酶活之间的关系的研究结果一致。平均相对变化率表明，印度芥菜组的平均R最大，表明种植印度芥菜对土壤脲酶的提升作用最为明显。平均抑制率显示，印度芥菜组的平均抑制率最小，由于低浓度铀对土壤脲酶有促进作用．所以不能采用平均抑制率来对比不同植物对土壤脲酶的保护作用。而最大抑制率表明，鬼针草组的最大抑制率最小，表明种植鬼针草对土壤脲酶保护效果最好。结合图l中种植鬼针草组U1、U2、U3对脲酶活性抑制作用不显著，综合分析，3种植物对根际脲酶酶活性提升效果表现为：印度芥菜>鬼针草>反枝苋，这说明是由于印度芥菜的根系提高根际脲酶的活性。但3种植物对铀污染条件下对土壤脲酶的保护效果表现为鬼针草>印度芥菜>反枝苋，这说明鬼针草的根际土壤脲酶所受铀的毒害较轻。
2.2铀对3种植物根际酸性磷酸酶酶活性的影响
有机磷是土壤中磷的重要成分，通过磷酸酶把有机磷催化为无机磷后，植物根系才能吸收利用。因此，土壤磷酸酶可以表征有机磷转化的生化活性。实验结果如图2所示，反枝苋组与空白组的趋势最为相似，U1、U2作用不显著，U3、U4、U5显著抑制磷酸酶的活性，随着铀浓度的增大抑制作用增强；鬼针草组的U1、U2、U3、U4均显著抑制磷酸酶活性且这4个处理间的抑制作用变化不显著，U5的抑制率最大；印度芥菜组除了U1外，均显著抑制磷酸酶活性。总的来看，低浓度的铀对土壤磷酸酶的作用不显著，但高浓度铀对土壤磷酸酶有显著抑制作用且随着浓度的增加抑制作用逐渐增强。这可能是因为铀与土壤酶没有专一性对应关系，酶活性不受影响，所以低浓度铀的作用不显著；而中高浓度的铀对土壤磷酸酶的抑制原理可能与脲酶类似。
对比分析如表2所示，相关系数表明，铀浓度与不同实验组之间的相关系数均达到显著或极显著负相关，这说明土壤磷酸酶能表征铀的污染状况，可作为评价铀污染的指标这也与张飞等的研究结果一致。平均相对变化率表明，反枝苋组的平均R最大，表明种植反枝苋对土壤磷酸酶的提升作用最为明显。平均抑制率显示，印度芥菜组的平均抑制率最小，而最大抑制率表明，印度芥菜组的最大抑制率最小，综合这2种指标说明种植印度芥菜对根际磷酸酶酶活性保护较好。综合所有指标考虑，种植反枝苋能较高的提升根际磷酸酶酶活活性，种植印度芥菜能更好的保护土壤磷酸酶酶活使之较少受到铀污染的抑制。
2.3铀对3种植物根际蔗糖酶酶活性的影响
蔗糖酶能够增加土壤中易溶性营养物质，因此蔗糖酶可用来表征土壤中生物学活性强度，而土壤肥力越高，蔗糖酶的活性就会越高。实验结果如图3所示，不同实验组间蔗糖酶变化趋势并不一致，而且蔗糖酶酶活性随着铀浓度的增加会出现先降低后升高再降低的“抗酶活性”现象，已有研究者证明这种“抗性峰”有时会出现多个。空白组中，不同浓度铀对蔗糖酶的酶活性均有显著抑制作用，但抑制作用并不随着铀浓度的增加而增强，而是出现2个“抗性峰”；反枝苋组与空白组类似，只是“抗性峰”只有一个；而鬼针草组不同浓度铀对酶活性也有抑制作用，在U2和U4处各出现一个“抗性峰”且U2的抑制作用不显著；印度芥菜组中除U1外其他浓度的铀均对酶活铀显著抑制作用，在U4处出现了一个“抗性峰”。综合
分析，蔗糖酶酶活性受铀污染的抑制，但对铀污染敏感性较低。这与已有研究发现蔗糖酶的稳定性高，不容易随着环境条件变化而发生强烈的变化的研究结果一致。
对比分析如表3所示，相关系数表明，蔗糖酶酶活性与铀浓度无显著相关关系，说明蔗糖酶不能表征铀的污染程度。平均相对变化率表明，鬼针草最能提高蔗糖酶的酶活性。平均抑制率表明，印度芥菜组中蔗糖酶酶活性受铀污染的抑制最小；而最大抑制率表明，印度芥菜组的最大抑制率最低，不同实验组中最大抑制率出现的位置不同，并且均不在最大铀浓度处。这说明印度芥菜最能保护蔗糖酶酶活性，使之较少的受到铀污染的抑制，但是铀浓度的升高并不能较高程度上抑制蔗糖酶的活性。
2.4铀对3种植物根际脱氢酶酶活性的影响
脱氢酶是一种只在细胞内有活性的酶，其活性更能表示污染物对土壤的影响。实验结果如图4所示，不同实验组显示，土壤脱氢酶酶活性均随着铀浓度的增加而受到抑制，并且抑制作用随着铀浓度的增大而显著增强。具体来活，空白组中U1对脱氢酶的活性的抑制未达到显著水平，U2与U3相比差异未达到显著水平；反枝苋组，每个种处理与CK相比均显著抑制脱氢酶酶活，除U3与U4间未达到显著水平外其他每两种处理间相比均达到显著水平；而鬼针草组和印度芥菜组每种处理间相比均达到了显著水平。这与高秀丽等研究发现的镉和铅对脱氢酶活性有“先抑后促”的现象不同，而脱氢酶是胞内酶，说明铀对细胞的作用机理与镉和铅不同。
对比分析如表4所示，相关系数表明，不同实验组中脱氢酶酶活性与铀浓度呈显著或极显著负相关，能用脱氢酶表征铀污染状况。平均相对变化率显示，印度芥菜组的根际土壤脱氢酶相对变化率最高，反枝苋最低。平均抑制率表明，反枝苋组的抑制率最低；而最大抑制率的结果与平均抑制率的结果一样。这表明，印度芥菜对根际土壤脱氢酶的活性提高效果较好，种植反枝苋能较好的保护根际土壤脱氢酶活性使之较少的受到铀污染的抑制。
2.5不同植物与不同土壤酶的关系比较
将同一同酶受不同实验组影响的平均相对变化率、平均抑制率和最大抑制率进行均值对比（表5）发现，平均变化率表现为：脱氢酶>酸性磷酸酶>蔗糖酶>脲酶；平均抑制率表现为：脱氢酶>蔗糖酶>酸性磷酸酶>脲酶；最大抑制率表现为：脱氢酶>酸性磷酸酶>蔗糖酶>脲酶。说明种植植物后脱氢酶活性的提升最为明显；添加不同浓度的铀后脱氢酶受到的抑制作用最强，这也从另一方面反应出脱氢酶比其他3种酶更为敏感。
将不同实验组的平均相对变化率、平均抑制率和最大抑制率进行均值对比（表6）发现，平均变化率方面，印度芥菜组>反枝苋组>鬼针草组；平均抑制率方面，鬼针草组>空白组>印度芥菜组>反枝苋组；最大抑制率方面，印度芥菜组>鬼针草组>空白组>反枝苋组，但是数值相差不大。说明种植3种植物均能提高土壤酶活性，且印度芥菜和反枝苋对其提升效果最好，而种植反枝苋后土壤酶活受剑的抑制作用最小。
3结论
(1)盆栽控制性实验表明，铀对不同实验组4种酶活均有抑制作用。随着铀浓度的变化，土壤脲酶有“低促高抑”的现象；土壤磷酸酶受抑制作用增强；蔗糖酶会出现1—2个抗性峰；脱氢酶酶活值显著下降。脱氢酶、酸性磷酸酶和脲酶，能作为表征铀的污染的酶学指标，其中脱氢酶最为敏感。
(2)不同植物对不同根际酶酶活性的提升方面存在差异。印度芥菜最能提升土壤脲酶和土壤脱氢酶活性；反枝苋最能提高土壤酸性磷酸酶活性；鬼针草最能提高土壤蔗糖酶活性。4种酶活均值发现：印度芥菜和反枝苋对土壤酶活的提升效果较好。
(3)不同植物在保护不同酶活性使之较少受到铀污染抑制的效果方面作用不同。鬼针草最能保护土壤脲酶活性；印度芥菜最能保护土壤酸性磷酸酶和土壤蔗糖酶活性；反枝苋最能保护土壤脱氢酶活性。对比不同酶活均值发现，反枝苋对铀污染土壤酶活保护效果最好。
