李明锐， 陈建军， 湛方栋， 李元， 祖艳群
（云南农业大学资源与环境学院，云南 昆明650201）
摘要：利用实验室已经筛选到的阿特拉滓降解菌株Arthrobacter sp．FM326为研究材料，研究了该降解菌在不同含水率(5%、15%、25%)的土壤和不同的水样中（农药厂排污水水样、晋宁蔬菜地沟渠水样、盘龙江水样）对阿特拉津的降解。实验结果表明，培养3d后，菌株FM326显著促进了污染土壤巾阿特拉津的降解（降解效率可达95%）。土壤含水率较低时，土壤中阿特拉津的降解作用主要靠微生物的作用。随着土壤含水率的增加，土壤中阿特拉津的物理化学降解作用增强，但仍以生物降解作用为主。培养5 d后，与对照相比，菌株FM326在3种水样中对阿特拉津均有显著的降解作用，其降解效率由大到小的顺序为：农药厂排污水水样(98%)>晋宁蔬菜地沟渠水样(91%)>盘龙江水样(86%)。
关键词：Arthrobacter sp．FM326; 阿特拉津；降解；微生物修复；土壤
阿特拉津（化学名称是2-氯-4-乙氨基-6-异丙氨基一1，3，5三嗪）是一种世界范围内广泛使用的除草剂，常用于甘蔗、玉米等农作物防除杂草。由于长期大量使用阿特拉津，且阿特拉津在环境中的半衰期较长，导致阿特拉津易残留在土壤和水环境中，或者进入食物链，进而给生态环境带来污染，给人类健康造成危害，是一种长期的潜在威胁，因此引起世界各国学者的广泛关注。
修复环境阿特拉津污染的方法有物理、化学和生物降解，由于阿特拉津降解的最主要机制是生物降解，而且生物降解有成本低、高效、无二次污染和操作简单等优点而成为研究的焦点。为了进行阿特拉津污染土壤的微生物修复，人们筛选出了大量的阿特拉津降解菌。本实验室也获得了阿特拉津降解菌Arthrobacter sp. FM326，该节杆菌能以阿特拉津为唯一的碳源和氮源生长，培养96 h后对1 000 mg/L阿特拉津降解效率达到97%。
微生物强化修复是修复农药污染土壤的主要方式，向环境中投加特定微生物分解污染物，修复被农药污染的环境。把具有降解能力的菌株投加入土壤中后，确实显著提高了阿特拉津的降解效率，发挥了修复污染的作用。Struthers等将分离到的Agrobacterium radiobacter J14a接种到受阿特拉津污染的土壤中，使阿特拉津的矿化速度提高2—5倍。Lima等将Pseudomonas ADP菌株与生物刺激（加入柠檬酸钠）结合起来，对污染土壤（60 mg/kg）修复1周，最终去除了98%的阿特拉津。刘春光等把Arthrobacter T3ABl接种到阿特拉津污染土壤中，试验证明菌株对后茬敏感作物水稻的各项生长指标（出苗率、株高、株鲜重等）能够起到很好的改善作用。
不同的降解菌株接种在土壤中，对阿特拉津的降解效果是不相同的，有些菌株可以迅速发挥作用，有些菌株会出现延滞。因为环境介质条件非常复杂，同时农药在自然环境中复杂的物理、化学反应及生物学变化，菌株的实际降解能力和效果不稳定，所以培养基中所反映出来的效果代表不了菌株在实际生态环境中的修复效果，因此还需要通过在实际环境介质中进行验证。
本文研究了实验室条件下降解菌FM326在不同含水率土壤中和不同水样（农药厂排污水、蔬菜地沟渠水和盘龙江水）中对阿特拉津的降解效果，为该菌株的进一步研究及修复环境中阿特拉津的污染提供理论依据和技术支撑。
1材料与方法
1.1材料
供试菌株：从昆明农药厂富民分厂土壤样品中分离而得的节杆菌属细菌FM326。
阿特拉津原药：纯度98%，山东滨农科技有限公司生产（由昆明农药厂富民分厂提供）。
1.2 土样的采集和制备
2012年5月4日，5点法布点采样，采集云南农业大学教学基地玉米田的土壤，除去土壤表面的杂草和枯枝落叶，采样深度约为20 cm。将所采样品等量均匀混合，自然风干，过20目筛，测定得土壤pH值为6.5，含水率为4.18%，全氮值为1.56 g/kg。土样中未检测出阿特拉津。
1.3水样采集方法及水样简介
1.3.1水样采集方法
提前准备好干净的矿泉水瓶或饮料瓶，直接用清洗干净的矿泉水瓶在5点分别采集1个水样，并将所采样点的水样混合。水样取回后迅速放冰箱4℃保存。水样的理化性质见表1。
1.3.2水样采样地
本实验采集了农药厂排污水水样、晋宁蔬菜地沟渠水样和盘龙江水样。农药厂排污水长期受农药的污染，水体的理化性质及其微生物组成必将受到影响。晋宁蔬菜地沟渠水是从蔬菜地里排出的水，水中杂物多，总不可滤残渣含量大，有机质等营养物质含量高，氨氮含量高。蔬菜地施用农药的种类和数量也较多。盘龙江源于昆明市北郊，而后由北向南纵穿昆明城而过，主要受到居民生活的污染，水样中含有大量氮、磷元素，具有生活污水的典型代表性。水样中均未检测出阿特拉津。
1.4 FM326菌株在土壤中对阿特拉津的降解试验
选取180个广口罐头瓶，称重记录。称取制备好的土壤，按50.0 g／杯的量分装到广口罐头瓶中，用一层布把口封起来。取其中90个罐头瓶灭菌（密封罐头瓶放入蒸汽高压灭菌锅中，121℃灭菌25 min），另外90个不灭菌。称取0.5 g阿特拉津原药，溶于少量丙酮中，再加入纯水，使阿特拉津分散均匀，定容到2L，得到阿特拉津浓度为250 yg/mL的悬浊液。吸取10 mL阿特拉津悬浊液，均匀施人土壤中，使土壤中阿特拉津浓度为50 p-g/g土。吸附24 h备用。
共进行4个处理，分别是：不灭菌不加菌( NSNA)、灭菌不加菌(SNA)、不灭菌加菌(NSA)、灭菌加菌(SA)。加菌处理组接人OD600值为l的菌悬液10 mL，根据土壤和罐头瓶的重量，调整土壤的含水量分别为5%、15%和25%，置于30℃培养箱中保温保湿培养，每天称瓶子和土壤的重量，保持土壤的含水量。分别在培养的第0天、3天、6天、9天、12天从培养箱中取出12个罐头瓶（4个处理，每个处理3个重复），提取土壤中的阿特拉津。
土壤样品中阿特拉津的提取：从样品中称取10 g土样于150 mL三角瓶，加入20 mL甲醇（分析纯），放在摇床上振荡30 min，转入离心管，在转速4 000 r/min离心8 min，上层清液用0.22um有机系滤膜过滤，将滤出液放在0℃下冷藏待测。
1.5降解茵在水样中对阿特拉津的降解试验
调整供试水样pH为7.0。将水样分装于250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，加入阿特拉津，使每瓶的阿特拉津含量为100 mg/L。在每瓶中加入1 mL FM326的菌悬液，菌悬液的制备见李明锐等。共进行4个处理，分别是：不灭菌不加菌( NSNA)、灭菌不加菌(SNA)、不灭菌加菌(NSA)、灭菌加菌(SA)，每个处理3个重复，共48瓶。灭菌的水样装入250 mL的三角瓶中，用一层布和一层牛皮纸封口后，放人蒸汽高压灭菌锅中灭菌（121℃灭菌25 min）。随后放置在30℃恒温摇床上120 r/min震荡培养，分别在Oh、24 h、72 h、120 h定时取3个重复，用0.22 ym有机系滤膜过滤培养液，收集滤液，待测。
1.6高效液相色谱法测定样品中阿特拉津含量
用高效液相色谱（安捷伦1200液相色谱仪，紫外可见检测器；色谱柱：18C反相硅胶色谱柱，10 yL微量进样器）检测滤液中的阿特拉津，同时以阿特拉津标准样品为对照。阿特拉津测定条件：甲醇：水=80:20，柱温25℃，波长222 nm，流速1 mL/min，保留时间2.3 min。
1.7 实验数据统计软件和统计方法
数据统计分析软件使用IBM SPSS Statistics21.0，使用单因素方差分析(ANOVA)，多重比较使用最小显著差数法(LSD)。
2结果与分析
2.1 降解菌FM326对土壤中阿特拉津的降解
2 .1.1含水量5%的土壤中FM326对阿特拉津的降解
在土壤的含水量是5%的土壤中，随着培养时间的增加，4种处理的阿特拉津含量均显著的降低(图1)。加菌的2个处理比没有加菌的2个处理的阿特拉津含量降低的速度更快。
不灭菌不加菌( NSNA)这个处理中，阿特拉津的降解主要是其在土壤中的物理化学或者光降解和土著微生物的降解组成；灭菌不加菌(SNA)这个处理中，阿特拉津的降解主要是其在土壤中的物理化学或者光降解。在培养的过程中，这2个处理的阿特拉津残留量只有在第9天的时候有显著的差异，其它时间都达不到显著差异，这说明在土壤的含水量是5%时，土壤中的土著微生物对阿特拉津的降解几乎不起作用，阿特拉津的降解主要是物理化学或者光降解等自然降解。
在不灭菌加菌(NSA)这个处理中，阿特拉津的残留量迅速下降，在第3天已经降解了95%。在灭菌加菌(SA)这个处理中，阿特拉津的降解相对缓慢，但在第6天时降解效率达到96%。比较2个处理得知，在不灭菌加菌这个处理中，阿特拉津迅速降解，除了添加菌株起到降解的作用，土著微生物也起到了协同作用；在灭菌加菌这个处理中，加入的降解菌株首先需要适应土壤的生存环境，再进行生长繁殖从而降解阿特拉津，因此降解过程相对缓慢。
培养到试验结束的时候(12 d)，进行了生物强化（额外添加降解菌）的2个处理，阿特拉津的残留量极显著(p<0.01)的低于没有进行生物强化的2个处理（没有额外添加降解菌）。这充分证明了FM326作为生物强化的菌种降解阿特拉津是可行的。
2 .1.2含水量15%的土壤中FM326对阿特拉津的降解
在土壤含水量为15%时，4个处理的阿特拉津的残留量随着培养时间的增加而显著降低，见图2。
不灭菌加菌和灭菌加菌这2个处理比较，在培养开始时(0 d)，由于实验误差，不灭菌加菌这一处理的阿特拉津提取量就显著的高于灭菌加菌的处理。但是可能由于土壤水分比较适宜降解菌的生长繁殖，在培养的第3天，两个处理的阿特拉津残留量就基本持平。随后的培养时间里，由于阿特拉津降解菌继续保持较强的降解能力，灭菌加菌这一处理的阿特拉津残留量都是几个处理中最低的。说明在土壤15%的含水量条件下，阿特拉津降解菌的降解能力旺盛，相比较而言，土著微生物的活性可以忽略不计，甚至由于它和降解菌在生存方面的竞争，在一定程度上阻碍了降解菌的降解。
2 .1.3含水量25%的土壤中FM326对阿特拉津的降解
25%的含水量接近土壤的饱和含水量，从图3可以看出，阿特拉津的降解仍以生物降解为主。
在土壤的含水量是25%时，试验提取测定的阿特拉津残留量的数据波动性较大。2个没有进行生物强化的处理（NSNA和SNA），在培养的前9d，阿特拉津的残留量没有发生显著的变化，培养到第12天时，阿特拉津的残留量显著降低。与土壤含水量为5%(图1)和15%(图2)时的2个相同处理比较，阿特拉津的残留量有随着土壤含水量的增加而显著降低的趋势，说明随土壤含水量增加，阿特拉津在土壤中的物理化学降解作用逐渐增强。
进行了生物强化的2个处理（NSA和NA），阿特拉津的残留量在培养的前6d降低不显著，从培养的第9天开始，阿特拉津的残留量显著降低。在培养结束时，4个处理的阿特拉津含量没有显著差异，这说明在25%的饱和含水量，土壤中阿特拉津的物理化学降解能力很强，但仍以生物降解为主。
2.2 降解茵FM326对水样中阿特拉津的降解
2.2.1农药厂排污水水样中FM326对阿特拉津的降解
图4可以看出，4种处理的阿特拉津含量随着培养时间的增加而显著降低，加菌的2个处理的阿特拉津含量在培养的过程中显著的低于不加菌的2个处理。培养ld的时候，添加降解菌的2个处理，水样中阿特拉津的降解效率分别是77%(NSA)和79%( SA)，显著高于不添加降解菌的2个处理。到培养的5d的时候，添加降解菌的2个处理，水样中阿特拉津的降解效率分别是95%(NSA)和98%( SA)。试验结果证明了降解菌在阿特拉津降解过程中起到了重要的作用。没有添加降解菌的2个处理，培养结束时水样中阿特拉津的降解效率分别是21%(NSNA)和8.3%( SNA)。这2个处理的降解可能是阿特拉津在培养的过程中，发生了物理化学分解和光降解的损失量，以及污染水体中土著微生物的作用。
2.2.2蔬菜地沟渠水中FM326对阿特拉津的降解
在晋宁蔬菜地沟渠水样中，在培养的过程中(图5)，额外加菌的2个处理（NSA和SA）阿特拉津含量在培养结束时显著降低，阿特拉津的残留量分别是6.35 mg/L(不灭菌)和6.47 mg/L(不灭菌)。在培养的第1天，不灭菌加菌的阿特拉津含量显著的高于灭菌加菌，可能是因为在不灭菌的水中加入降解菌后，水样中的土著微生物没有协助阿特拉津的降解，相反与降解菌的生长、繁殖和对营养的获得有一个竞争和适应的阶段，导致降解菌降解能力有一个延缓阶段。
NSNA和SAN这2个处理的阿特拉津含量在培养的过程达不到显著差异，说明在这样的蔬菜地沟渠水体中，水体的理化特性决定了阿特拉津的物理化学降解和土著微生物的降解很小，几乎可以忽略不及。
2.2.3盘龙江水中FM326对阿特拉津的降解
在盘龙江水样中（图6），4个处理的阿特拉津含量随着时间的增加均显著降低，但是加菌这2个处理的阿特拉津含量显著的比不加菌的2个处理降解的多。
培养结束时(5 d)，额外添加降解菌的阿特拉津残留量是10.36 mg/L(不灭菌)和31.46 mg/L(灭菌)。前者的降解能力显著高于后者，说明盘龙江水样中的土著微生物在阿特拉津的降解过程中起到了极大的协同作用。
3讨论
许多研究证实，微生物强化作用可以降解环境中的阿特拉津。Aislabie等向10 g土壤中加入阿特拉津和西玛津，接种Arthrobacter降解菌确实提高了阿特拉津和西玛津的降解。郑柳柳等巴Arthrobactersp. AD30和Pseudomonas sp．AD39的混合菌液接种阿特拉津浓度为176 mg/L的工业废水，30℃振荡培养72 h以后，99.1%的阿特拉津被去除。土壤中的阿特拉津污染较轻时，用生物强化就可以快速降解阿特拉津；当土壤中的阿特拉津污染较严重时，生物强化和生物刺激共同作用来降解土壤中的阿特拉津。本文中，把FM326加入到土壤和水中，显著提高了阿特拉津降解效率，起到了对污染环境介质的修复作用。
然而，使用活的微生物进行生物修复存在许多局限，例如，土壤中的水分含量、土壤类型和土壤质地、阿特拉津施用年限、土壤pH值、缺乏养分、土壤中微生物群落的组成和数量大小、有毒物质和盐分等，这些因素影响微生物的生存或者降解速率。
在本实验中，不同含水量影响了阿特拉津在土壤中的降解过程．不同性质的水样影响了阿特拉津在水中的降解。培养结束时，在5%、15%和25%的含水量土壤中，阿特拉津的残留量分别是20.5—23.6u g /g、14.4~22.8 u g /g和3.7—6.5 u g /g。这说明，随着土壤湿度的增加，阿特拉津的降解就越彻底。代先祝等研究表明，菌株Arthrobacter sp．AG1降解完土壤中的阿特拉津后，在土壤含水量分别为5%和15%的情况下能长期保持降解活性，对60 d后第2次施入黄棕壤和潮土中的50 mg/kg阿特拉津4d时降解效率在65%以上。土壤中水分含量对降解效果影响较大，>20%时降解效果较好，这与本实验得到的结论相一致。
把活的微生物接种到实际的环境中，受到上述环境因素的影响，使得生物强化在实际应用中容易失败。近年来，如何把微生物固定起来进行实际环境的污染治理成为人们关注的焦点。
4结论
(1)利用降解菌FM326进行生物强化处理，可以显著的促进土壤和水样中阿特拉津的降解。土壤中培养3d后，降解效率可达95%;水样中培养5d后，降解效率可达98%。
(2)菌株FM326在土壤中降解阿特拉津时，受到土壤含水率的影响。在土壤含水率为15%时，菌株的降解能力最显著。
(3)不同的水样，因其不同的土著微生物和物理化学特性，显著地影响着FM326对阿特拉津的降解。
