分子生物技术在厌氧氨氧化工艺研究中的应用

户海燕  瞿思宜  张正哲  施曼玲  金仁村

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州310036）

摘要：厌氧氨氧化（anaerobic ammonium oxidation．anammox）工艺是一种高效低耗的新型废水生物脱氮工艺，具有广阔的应用前景。但迄今为止该工艺的主要承载者厌氧氨氧化菌未获得纯培物，因此传统的微生物学方法不足以研究其生物学特性。分子生物技术的发展改变了传统的微生物学研究方法，其中，变性梯度凝胶电泳( DGGE)、荧光原位杂交(FISH)、实时荧光定量PCR( qPCR)、高通量测序和基因芯片技术脱颖而出。文章重点介绍了这些技术在氧氨氧化工艺研究中的应用，以及其主要的优点和缺点。将分子生物技术应用到厌氧氨氧化T艺研究中，对于全面认识厌氧氨氧化菌的性质、解析厌氧氨氧化工艺的微生物学机理、确保工艺的长期高效稳定运行具有重要意义。

  关键词：厌氧氨氧化工艺；分子生物技术；荧光原位杂交；实时荧光定量PCR；高通量测序；基因芯片

 厌氧氨氧化( anammox)工艺是由荷兰Delft大学于1990年研究开发，并在实际废水处理中得到成功应用的一种新型废水生物脱氮工艺。它以anammox反应为基础，该反应依靠厌氧氨氧化菌( AnAOB)特殊的代谢机制，在厌氧条件下，以氨为电子供体，亚硝酸盐为电子受体反应生成氮气。Anammox工艺以高效低耗的优势在废水生物脱氮领域具有广阔的应用前景。然而，由于AnAOB倍增时间很长(11 d)，迄今为止仍未获得AnAOB的纯培物，且anammox反应器中微生物的种类、丰度及相互之间的关系一直被认为是黑匣子，所以传统的微生物分析方法——基于纯培物的分离进行形态、代谢、生化和遗传分析的方法，受到了很大的限制。

 20世纪90年代发展起来的一套新的分子生物技术彻底改变了微生物学研究，与传统的研究方法不同的是，它不需要将微生物分离就可以鉴别特定种群，已成为微生物生物学特性研究的新平台。分子生物技术近年来发展迅速，尤其在anammox工艺等废水脱氮研究领域崭露头角，它基于有“分子进化钟”之称的小核糖体亚基的RNA（原核生物为16S rRNA）及其相应的基因进行研究。在这些技术中，DGGE、FISHqPCR、高通量测序和基因芯片等以独特的优势脱颖而出，具有一定的代表性。DGGE、FISH和高通量测序技术能够将anammox工艺中微生物的种类、丰度及群落关系可视化，qPCR可以作为指示参数直接监测反应器内AnAOB的数量变化，同时，基因芯片(GeoChip)能够将微生物群落结构与功能紧密结合，这对于全面认识厌氧氨氧化菌的性质，解析厌氧氨氧化工艺的微生物学机理，快速启动anammox工艺及提高其性能的有重要意义。

 文章重点介绍了DGGE、qPCR、FISH、高通量测序和基因芯片等分子生物技术在anammox工艺研究的应用，并总结其主要的优缺点。这些技术最近已经开发，主要用于实验室规模，在不久的将来，这些技术会成为设计和管理生产规模anammox工艺的评估工具。

1变性梯度凝胶电泳

 分子指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳(DGGE)，温度梯度凝胶电泳(Temperature gradient gelelectrophoresis，TGGE)和末端限制性片段长度多态性分析( Terminal-restriction fragment length polymor-phism，T-RFLP)，在这些技术中，较为常用的是DGGE。根据DNA分子在不同梯度的变性剂中解链行为的不同而具有不同电泳迁移率的特点，将片段大小相等而碱基组成不同的DNA片段分开，每个条带代表一个微生物种类，DGGE产生的结果可以直接反映群落多样性。同时，也可以通过回收目的条带进行片段测序获得系统发育信息。

目前，已发现并鉴定的AnAOB有6属19种(表1)，其中大部分AnAOB分离自污水处理厂或实验室反应器样品，少部分分离自海水样品，但均没有获得纯培物。Strous等最早采用PCR-DGGE技术鉴定一种新的AnAOB，并命名为Candidatus Brocadiaanammoxidans。Schmid等基于PCR-DGGE方法在德国几个污水处理厂发现了新的16S rRNA序列，与已发现的Candidatus Brocadia anammoxidans的16SrRNA序列相似性小于90%，因此，这种新的AnAOB被命名为Candidatus Kuenenia stuttgartiensis；Park等研究了不同接种源和运行方式对anammox反应器中微生物群落的影响，通过PCR-DGGE分析发现，随着序批式反应器(SBR)稳定运行，其中AnAOB的优势菌从Candidatus Kuenenia stuttgartiensis转变为Candidatus Brocadia fulgida昶Candidatu Brocadiasp. 40，全程自养脱氮反应器(CANON)也逐渐以Candidatus Brocadia sp. 40为优势菌，结果表明反应器中接种源和运行方式对AnAOB优势种的选择不大重要。结合PCR技术，DGGE可以简单分析出反应器中菌群的种类，可以作为AnAOB富集简单的检测指标。

 DGGE能够方便快捷地检测AnAOB群落的时空动态，同时结合PCR可对目的条带进行系统发育分析，相对传统的分离培养技术有很大的改进。尽管该技术已得到广泛应用，它仍然存在一些缺点，比如，扩增片段长度限制在100~500 bp，与通过克隆16s rRNA基因建立的系统发育关系相比，DGGE不太可靠；扩增后DNA拷贝数可能发生变化，DGGE条带的亮度可能会因此改变，从而对优势菌群的预测出现错误；检测的样本数量通常较少，这意味着能确定的物种也少，因此较亮的条带对应可能不是原样品的优势种群。

2荧光原位杂交

 核酸杂交法利用短的寡核苷酸探针（约15～25 bp）特异性结合目标核酸，从而检测原位或非原位细胞。斑点印迹法是一种非原位方法，通过评估基因表达水平的相对变化来探究一个群落的代谢活动，然而由于基因表达模式与环境条件显著相关，这种技术用于微生物量化有一定的局限性。荧光原位杂交(Fluorescence in Situ Hybridization，FISH)是用荧光标记的已知核苷酸序列的探针在细胞内和特异的互补核酸序列杂交，通过激发的荧光信号来检测样品的方法。基于其原位的性质，通过荧光显微镜成像，可分析反应器中AnAOB群落的丰度和分布。由于不需要提取核酸，近年来该方法广泛应用于anammox工艺诊断中。

目前FISH中使用的寡核苷酸探针主要依据16S rRNA分子的核苷酸序列来设计，长度一般为15—30 bp，通常在寡核苷酸探针的5 ’端通过共价键与荧光染料相连。表2列举了用于AnAOB FISH实验的寡核苷酸探针。

 FISH技术将anammox反应器中未知的群落分布可视化，作为AnAOB的鉴定方法的同时，在一定程度上能真实地反映anammox颗粒污泥内部微生物的组成和空间分布情况[别。基于16S rRNA基因的靶向探针，van der Star等对生产规模反应器启动的不同阶段进行研究，结果表明Candidatus Brocadia -直是anammox颗粒污泥的优势菌种，Guven等通过FISH证实了连续搅拌反应器( CSTR)中的优势菌种为Candidatus Brocadia anammoxidans。Third等用体积分数为10%的氨氧化菌接种到厌氧氨氧化反应器中以启动全程自养脱氮工艺，通过特异性FISH探针鉴定了富集产物AnAOB，并在anammox富集物中发现了新的AnAOB。Rincon等提出用于研究anammox工艺的分子生物技术，包括FISH和浮霉菌门特异性PCR。Hu等使用Cy3标记的Amx820探针和DAPI对8个anammox反应器中的AnAOB进行检测和定量，FISH结果显示8个反应器中只有一种AnAOB占优势，研究表明同一接种源可用于接种处理不同污水的反应器，有利于生物反应器的快速启动。近两年，FISH在anammox工艺中的应用已接近成熟，通过多种探针结合，FISH图片可以清晰反映反应器中AnAOB群落的变化，从而为改善工艺性能提供依据。Lotti等研究了流化床颗粒污泥反应器中温度的降低（从20℃到10℃）对微生物群落的影响，通过FISH图片可以清晰地观察到AnAOB在总菌中的比例逐渐增大，随着温度的降低，有机物逐渐消耗，但异养菌不能战胜AnAOB成为优势菌群，同时也表明AnAOB在市政废水低温处理过程中有一定的优势。

 由于能直观反映AnAOB的分布而不破坏微生物的原位生态结构，灵敏度高，探针能长时间保存等优点，FISH技术在微生物群落解析中得到广泛应用，技术水平也逐渐成熟。但是仍然有其不足之处：(1)在检测和定量前，需要知道目标菌群16S rRNA序列；(2)-方面，随着AnAOB的不断发现，已有的探针不足以测定所有的AnAOB，探针需要不断更新；另一方面，新探针的设计以及杂交条件的优化比较困难；(3)荧光信号弱、清晰度差；(4)对于生长缓慢的AnAOB，由于其rRNA含量低而很难被探测到。尽管如此，随着研究人员的不断努力及技术的不断进步，FISH将会有更强的实用性和可操作性，并且随着AnAOB新探针的研发，能更深入了解anammox工艺的微生物学机理。

3实时荧光定量PCR

 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)技术通过荧光信号对PCR进程进行实时监测，因其灵敏度高，操作简单方便，实时性和准确性，已广泛应用于反应器内微生物的定量分析。用于定量检测的荧光分子有多种，包括非特异性DNA结合染料，水解探针，杂交探针，发光探针和分子信标等。尽管每一种检测方法有其独特性，但在所有的方法中，荧光信号的水平均反映目标扩增子的积累量。其中，SYBRGreen I和TaqMan assays是当前研究中最为广泛使用的方法。Anammox反应器的启动过程，实际上就是AnAOB的富集积累的过程，但AnAOB生长缓慢，阻碍了anammox工艺的推广应用，为了克服这种限制，以16S rRNA基因和特异性功能基因作为标记的qPCR方法得到广泛应用。

 Tsushima等首次将qPCR应用于anammox工艺中。作者使用生物转盘富集AnAOB，基于富集物的16S rRNA基因序列，设计了一对用于厌氧氨氧化菌定量的引物，并且使用SYBR Green I得到成功应用。厌氧氨氧化菌16S rRNA基因丰度的增加与氮去除率的增加显著相关。qPCR的结果估算富集培养物中厌氧氨氧化菌的倍增时间为3.6～5.4 d。这一研究表明qPCR是评估anammox工艺中AnAOB生长状态极为有价值的方法。

 van der Star等也做了早期的研究，由于反应器启动阶段厌氧氨氧化菌活性较低不能用传统的方法鉴定，因此作者用qPCR来监测厌氧氨氧化厌氧氨氧化菌的生长，同时研发TaqMan探针进行qPCR的检测方法，并且证明了这种定量方法的可靠性从qPCR监测结果来看，生物量倍增时间为9—17 d。此研究提供的分析方法可能对厌氧氨氧化反应器的设计和运行有用。

 Bae等采用序批式反应器富集5个不同活性污泥样品的AnAOB，运行70 d后，通过qPCR检测其中AnAOB拷贝数，结果发现污水处理厂活性污泥中存在大量AnAOB。数据分析表明，即使在好氧活性污泥中，AnAOB丰度也很高，这就为好氧活性污泥适用于接种anammox反应器提供了理论依据。该研究估算的AnAOB倍增时间与之前报道的数值相比显著缩短，同时表明活性污泥可以作为生产规模anammox工艺快速启动的接种源。

Harhangi等指出以16S rRNA基因为目标序列设计的引物并不能够完全检测出AnAOB，因此通过比较找出AnAOB定量的一对最佳引物hzsA_1597F和hzsA_1857R（表3）。hzsA是编码联氨合成酶(Hydrazine Synthase)A亚基的基因，目前，该基因没有在其它微生物基因组中发现，因此是很好的分子标记物。Hu等以水稻土为接种源，经过18个月富集AnAOB，分别以hzsA和16S rRNA基因为目标对AnAOB和总细菌进行定量，qPCR检测显示富集培养物中AnAOB增至1010拷贝g（干重），并据此推算出倍增时间为40 d，该研究为稻田土壤中AnAOB的存在提供了证据。

  作为微生物群落分析的手段，通过使用特异性寡核苷酸引物对目标菌群进行定量，qPCR在anammox工艺研究中的优越性愈显突出。在anammox工艺中，实时监测对评估微生物群落动态，提高工艺性能，鉴别优势微生物种群至关重要。qPCR是目前计算目标基因拷贝数最精确的方法。虽然，从理论上讲，qPCR可以特异性地检测到任何目标序列，但特异性和灵敏性的分析主要受引物特异性影响。因此，在anammox反应器这样的混培体系中，特异性引物的设计对分析至关重要。同时，样品中核酸提取效率、寡核苷酸引物的特异性以及无活性DNA的扩增等可能引起目标序列低估或高估。总之，在理解局限性因素的基础上，qPCR定量必须要精心设计、实验和验证，才能更好地应用于anammox工艺研究。

4高通量测序技术

 在Giovannoni等进行开创性的工作之后，基于16S rRNA基因文库的分析已广泛应用于各种废水处理系统的综合性分类分析。编码16S rRNA基因的克隆和测序仍然应用最为广泛，然而为了确保有代表性的克隆文库，必须要构建大量克隆，这就增加了分析花费的时间，且不适用于大量样品的分析。

 高通量测序技术（High-Throughput Sequencing）的应用弥补了这一缺陷，该技术又称“下一代”测序技术，一次性对几十万到几百万条DNA分子进行同时测序，进而可对一个物种的转录组和基因组进行深人、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。16S rRNA基因序列由9个高变区组成，中间穿插着保守区，是最常用的细菌分类标准。Anammox工艺中样品的16S rRNA基因测序的基本过程是：提取样品DNA，扩增其16S rRNA基因，构建测序文库，然后上机测序。测序完成后，优化处理过的序列，通过Mothur或QIIME数据平台进行序列比对，16S rRNA基因序列的多样性可反映样品中微生物的分类和丰度。

 Gonzalez Gil等通过16S rRNA基因焦磷酸测序分析了生产规模anammox反应器中微生物群落结构，结果表明AnAOB、发酵型厌氧菌和异养反硝化菌是颗粒污泥的优势菌群，其中Candidatus Brocadia占总菌群的1/3(32%)，并通过测序结果分析反应器中菌群之间的合作和竞争关系。Gilbert等通过IlluminaMiSeq测序平台检测低温下短程硝化-anammox移动床生物膜反应器中菌群动态变化，结果发现随着温度的降低，虽然AnAOB的丰度有所降低，但优势菌自始至终是Candidatus Brocadia，AnAOB的种类并没有发生变化，即是Candidatus Brocadia对低温的适应过程。

 高通量测序数据分析可以准确、直观描述微生物种群的分类和丰度，同时也是发现新的AnAOB的一种途径，对anammox工艺性能的提高有着重要的作用，是新兴的也广为认可的分子生物技术。高通量测序具有测序通量高，可重复性强，实验周期短，测序数据便于进行生物信息分析等独特优势。然而，这项技术也面临着一些问题。首先，不同的测序平台各有其优缺点，性价比和读长成为亟待解决的问题。其次，由于高通量测序对丰度较低的基因序列有一定的选择性，这可能导致一些AnAOB序列的遗失。再次，其分析方法较为复杂，并且由于通量的限制，信息深度、定量性还不够好。但是随着这项技术的广泛应用，相信一定会有较好的解决办法，从而更好地用于研究。

5基因芯片

 基因芯片是在基因探针的基础上研制出的一种小型化的DNA陈列，又称DNA微阵歹J(DNA microarray)。通过基因芯片可对目标序列测序，步骤如下：(1)将大量已知的DNA探针集成于固体基质的表面，产生二维DNA探针阵列。(2)将荧光标记后的目标序列与之杂交。(3)检测杂交信号，对生物样品的大量基因进行分析。用于anammoxI艺研究的基因芯片主要是功能基因芯片( GeoChip)。GeoChip能够将微生物群落的结构和功能紧密结合，与高通量测序技术相互补充，可用于研究anammox反应器中微生物群落功能结构和代谢功能。

 最新版本的功能基因芯片GeoChip 4.0对应410个功能基因类别，包括氮循环、碳循环、重金属抗性、有机修复和应激反应在内的152 414个功能基因，是一种强有力的微生物群落功能基因分析工具。Zhao等将GeoChip 4.0应用到一体式短程硝化-anammox反应器微生物群落检测中，该反应器用于处理厌氧消化上清液（含高浓度氨氮污染物），经过对基因丰度和多样性分析发现，在运行稳定的生物反应器中微生物群落随环境条件的变化有明显的不同，功能基因的多样性随消化上清液百分比的增多而减少，与有机修复和重金属抗性相关的基因丰度较高，anammox相关基因丰度相对稳定。结果表明含氮化合物、碳氮比以及运行参数（pH和温度）是决定反应器中微生物群落结构的关键变量，这也为工艺稳定运行提供重要信息。

 基因芯片技术经过多年的发展形成了一个系统平台，积累了大量的公共数据。它适合对未获得纯培物的AnAOB进行已知信息的检测，同时能够将反应器中微生物群落结构与功能结合起来进行分析；基于成熟完整的基因芯片分析理论，便于对数据进行分析。然而，这样的高通量快速检测技术也存在一些缺点，例如，它只能对已知序列进行检测，不能用于寻找新基因，而这对于未知AnAOB的探究是非常有必要的。高通量测序能弥补这一缺陷，通过高通量测序获取新基因信息，同时利用基因芯片对这些信息进行高通量、低成本快速检测，从而在短时间内获得大量有效数据。

6总结与展望

 从微生物学角度来讲，Anammox工艺的运行是AnAOB驯化富集的过程，因此，AnAOB的群落动态，群落数量及群落结构决定了反应器脱氮性能。分子生物技术的应用扩大了微观层面上对anammox污水处理系统的理解，通过分析anammox工艺运行与微生物群落结构的关系，有助于了解anammox反应脱氮机理，优化反应器运行性能，并提高对反应系统的管理。

 然而，必须考虑应用时的限制性因素，虽然在不久的将来不太可能避免，但是应该尽量了解并克服这些限制因素，从而探索出真实的群落结构动态。不同的技术各有千秋，采用DGGE、qPCR和高通量测序技术解析不同运行条件下反应器中AnAOB的群落结构和数量的动态变化，FISH将这一过程可视化，GeoChip能够将群落结构与功能结合。实际应用中，往往根据不同的目的择优选择或者将多种技术结合使用，同时只有将这些技术与设计思路完美结合，才能够更好地服务于工程研究。今后应努力的方向是：(1)改善传统的微生物学方法，结合现代分子生物技术分离鉴定出更多有实际应用价值的AnAOB。(2)研究anammox工艺中AnAOB和其它细菌之间的协作和竞争机制，阐明微生物群落结构及调节机制。(3)深入研究厌氧氨氧化菌的基因组学和蛋白质组学，改良厌氧氨氧化工艺的运行条件。相信随着技术的不断进步以及实验条件的不断优化，在不久的将来，这些技术会成为设计、跟踪和调控生产规模anammox工艺的有效工具。