摘要：使用国产BC-7L生物反应器对BHK-21细胞悬浮培养参数进行了初步研究。通过对培养液血清含量、pH、溶氧和搅拌转速逐一进行优化研究，最终确定了BHK-21细胞悬浮培养的最佳参数为：血清浓度为5%，pH为7.40、DO为50%，搅拌转速为100r/min。 关键词：生物反应器；BHK-21细胞；悬浮培养 动物细胞培养在生物技术和生物医药研究中已得到了广泛的应用。近几十年来，随着生物工程和组织工程学的发展，相应的生物反应器水平也在不断提高，现已研制出多种不同用途、型号的动物细胞生物反应器，其性能也日趋完善，种类越来越多，规模越来越大，在国外，已放大到5000 -10000L。悬浮培养技术最大优势是通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。由于动物细胞在悬浮培养过程中对培养基和培养条件要求很高，不易达到最佳生长状态，故本研究对生物反应器悬浮培养BHK-21细胞的培养条件进行了研究，以期使BHK-21细胞达到最佳生长状态，为后续规模化生产提供参考。 1 材料和方法 1.1 实验材料 BHK-21细胞，新生牛血清（四季青），DMEM（GBICO），NaHC03，消泡剂。 1.2 仪器设备 BC-7L生物反应器，为广州齐志生物工程设备有限公司产品。 1.3 实验方法 1.3.1 BHK-21悬浮细胞制备取BHK-21贴壁细胞种进行复苏，待细胞长满单层并生长状态良好时，用0.25%胰酶消化，之后用移液管轻轻吹打成单个细胞悬浮液，以0.5×106个/mL的密度接种300-1000mL摇瓶中，于90r/min恒温摇床培养。连续培养5代后，进行上罐培养。 1.3.2 血清含量对悬浮细胞培养的影响将摇瓶BHK-21细胞以0.5×106个/mL的密度接种至5生物反应器中进行培养，培养过程中血清含量分别调整2%、5%、10%三个浓度进行培养，培养过程中对各浓度细胞取样计细胞数并观察细胞形态。 1.3.3 培养液pH对悬浮细胞培养的影响在保持其它培养条件不变的情况下，分别设置DMEM培养液pH为7.0-7.2、7.2-7.4、7.4-7.6、7.6-7.8进行平行实验。37℃培养48h后，取样进行细胞计数并观察细胞形态。 1.3.4 培养液溶氧（DO）对悬浮细胞培养的影响在保持其它参数不改变的情况下，分别设置溶氧为40%、50%、60%、70%、80%，同样培养48h后取样计细胞数并观察细胞形态。 1.3.5 搅拌转速对悬浮培养细胞的影响在同样其它的参数条件下，只通过改变搅拌的转速来观察，转速对细胞形态的影响。分别设置转速为40r/min、70r/min、100r/min。 2 结果 2.1 血清含量对悬浮BHK-21生长的影响 对三个血清浓度下培养的细胞进行取样观察和细胞计数结果显示：2%血清浓度下，细胞生长极其缓慢，细胞密度显著低于另外两组；血清浓度为5%时，细胞生长良好，细胞密度显著高于2%组，但略低于10%血清浓度；10%血清浓度组，细胞生长好，细胞数最多。 2.2 培养液pH对悬浮BHK-21生长的影响 pH在一定小范围内变化，对细胞生长并不会产生大的影响，但如果变动幅度较大，则会造成细胞生长缓慢，状态不好。实验结果显示pH为7.4时，细胞生长最佳。 2.3 DO对悬浮BHK-21生长的影响 溶氧低，不足以维持细胞生长，溶氧高会增加02通入量，造成生产成本提高。从实验结果分析，50%的溶氧效果最好。 2.4 搅拌转速对BHK-21生长的影响 40r/min条件下，转速不足以提供足够的力量使细胞悬浮起来，观察到反应器底部沉积了较多的细胞；将转速提高至70r/min，细胞虽然不会再沉积到反应器底部，但是取样观察发现有较多的细胞聚集成团；继续提高转速至100r/min，细胞聚团情况得到解决，细咆生长良好。100r/min为最佳搅拌转速。 3 结论与分析 1）实验过程中，发现摇瓶转接生物反应器的时候，细胞密度不可过低，从本实验结果显示，如果当细胞密度低于2×105个/mL时，细胞生长则十分缓慢，有资料显示如果培养基与细胞的容积比例大于2000：1，生长物质弥散到细胞外过多，将使细胞内浓度低于最小限度的浓度，此时细胞不能再增殖，培养基的pH值变碱，抑制细胞生长，甚至引起细胞死亡等。 2）虽然血清浓度为10%时，细胞数高、状态好，但是与血清浓度为5%时相比，差异并不太大，综合考虑生产成本，应选择血清浓度为5%为最佳血清浓度。另外，所使用的血清质量也会影响细胞的生长状态，一般质量较好的血清在融化后呈透明、淡黄色，并且无支原体、病毒及其它微生物污染。血清浓度高有利于细胞分裂，细胞生长较快，但是高浓度的血清成分比较复杂，对后续的纯化不利，且价格较高，质量不稳定，因此选择开发和使用低血清培养基和无血清培养基成为未来的需求。 3）细胞聚集成团对细胞生长状态具有严重影响。如果结团严重，处于细胞团中间的细胞则会吸收营养物质不足，生长速度降低，从而引起细胞蛋白结构改变等一系列问题，使得细胞表达能力下降。一方面，提高搅拌速度可以改善细胞结团的情况，但较高的搅拌速度也会对细胞产生一定的影响，如果可以开发一种抑制细胞结团的试剂，势必将大大促进悬浮细胞的培养。
