胶原多肽螯合钙螯合工艺研究

 敖冉1，梁春辉1，王伟2，丁娜1，王伟静1，张；胜1*

 1．河北农业大学食品科技学院（保定071000）；2．中央司法警官学院（保定071000）

摘要试验以螯合率为指标，研究肽钙添加比例、温度、pH和时间四因素对猪皮胶原多肽螯合钙螯合效果的影响。通过设计单因素和正交试验对螯合效果进行优化，得到优化的螯合工艺的主要参数：肽钙比例3：1、pH 7、温度50℃、螯合时间30 min。并对所制备的胶原多肽螯合钙粉末进行傅立叶红外光谱和紫外吸收定性检测，发现均发生不同程度的峰移动，证明螯合前后胶原多肽-化学结构上发生了一定的变化，确定有新的螯合物生成。

关键词螯合；工艺；光谱检测

  当下钙缺乏问题已经成为全球性的营养问题，由于饮食偏好的原因，国民的膳食构成多以谷物、蔬菜为主，所含有的草酸、植酸等成分会严重阻碍钙的吸收。因此，我国的钙缺乏情况尤为严重，所以补钙成为我国膳食营养研究的重要课题。钙制剂的种类多种多样，市售的钙制剂包括无机钙制剂、有机钙制剂、生物钙制剂，虽然无机钙和有机钙成本较低，但因为其易流失、不易被人体吸收的特征，近年来人们把钙制剂的重点放在了开发易于被人体吸收、生物效价高的生物钙制剂上面，此类钙制剂可有效缓解骨质疏松等常见多发性疾病。钙制剂进人人体后需要借助于某些载体的作用才能被肠道吸收，这也是许多补钙产品效果不理想的重要原因，胶原多肽的分子结构特殊，在人体内是良好的补钙剂载体，多肽与钙结合为可溶性螯合物，这种螯合状态可以有效避免钙离子受消化道内其他成分的影响形成不溶性沉淀，同时在进入人体后多肽会被消化酶水解为小肽，这些小肽又会与钙离子进行二次结合，保证钙离子顺利到达钙吸收位点，促进小肠对钙的吸收。因此，研究胶原多肽螯合钙这种高浓度、高吸收补钙剂具有十分重要的意义。

 胶原多肽螯合钙的制备是利用新鲜猪皮酶法水解得到猪皮酶解原液，添加外源钙制剂进行螯合后制得，在螯合过程中需要控制外源钙的加入量、螯合体系的温度、pH、时间等主要影响因素。为了衡量螯合效果，试验选择螯合率作为指标，通过调节以上4个因素使螯合物产率达到最高。试验中应注意外源钙的加入量要做到既不浪费钙源又保证有足量的钙离子

与多肽进行螯合反应，螯合过程中体系的温度和pH对于螯合效果有极大的影响，必须严格控制体系温度和pH，并在此基础上确定适宜的螯合时间，以保证较高的螯合率。最后利用傅立叶红外光谱和紫外吸收对螯合钙进行定性分析确定新物质的生成。

1  材料与方法

1.1材料、试剂与设备

 猪皮胶原多肽酶解原液：实验室自制；乙二胺四乙酸钠、氯化钙、氢氧化钠、乙酸、无水乙醇、碳酸钙、钙羧酸指示剂、乙二胺、三乙醇胺、氨水：分析纯。

 WQF-510 FT-IR傅立叶变换红外光谱仪：瑞丽，中国；Unico-uv2800紫外分光光度计：上海优尼科；RE52CS旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；H．SWX-600BS电热恒温水浴锅：金坛市朗博仪器制造有限公司；分析天平( FA2014)：上海天平仪器厂；磁力搅拌器：金坛市医疗仪器厂；雷磁PHS-3C数显酸度计：中国雷磁分析仪器厂；电磁炉：苏泊尔有限公司；L3660D台式低速离心机：上海知信实验仪器技术有限公司。

1.2试验方法

1.2.1螯合率的测定

 采用改进的EDTA络合滴定法测定螯合率。

 选择乙二胺和三乙醇胺作为掩蔽剂替代氰化钠进行联合掩蔽，使样品中的铁铜铝锰等微量金属离子被充分掩蔽，消除指示剂的封闭现象，按公式(1)计算：

1.2.2胶原多肽螯合钙的定性检测

 傅立叶红外光谱法：用溴化钾压片法对胶原多肽与钙的螯合物进行红外光谱分析。

 螯合物的紫外吸收光谱分析：紫外可见分光光度计进行190～480 nm波长扫描。

2结果分析

2.1温度对螯合效果的影响

 不同温度对螯合效果的影响如图1所示。随着温度的上升螯合率呈现先上升后下降的趋势。当螯合体系温度处在40℃~60℃之间时，温度的升高能够显著促进螯合反应的进行，这主要是因为螯合反应是一个动态平衡的吸热反应，当温度上升加速了体系内部各反应底物之间的相对运动速度，提高了钙离子与胶原多肽的结合速率，所以螯合率会提高。但是当温度

高于60℃时，由于反应体系内部能量太高，维持螯合体系的各配位键键能过高导致螯合体系不稳定，此时螯合物的解离速度大于钙离子与胶原多肽的结合速度。因此，螯合率下降。

2.2 pH对螯合效果的影响

 不同pH对螯合效果的影响见图2。当pH从5增加到7时螯合率逐渐上升，当pH 7时螯合率最高，pH继续增大螯合率迅速下降。这种现象的出现是因为当pH在低于7并逐渐上升时与钙离子争夺供电子基团的氢离子浓度逐渐下降，这样随着pH的上升钙离子能够迅速的与胶原多肽结合生成螯合钙。当pH>7时，随着pH的上升，氢氧根离子浓度迅速增加，体系内的氢氧根离子优先抢夺钙离子生成氢氧化钙沉淀，不利于螯合钙的生成。因此，螯合率迅速下降。

2.3肽钙比例对螯合效果的影响

  不同肽钙比例对螯合效果的影响见图3。不同肽钙比例对螯合效果的影响整体呈现先上升后下降的趋势。当多肽与外源钙离子的比例由1:1上升到2:1时螯合率显著升高，这是因为较高浓度的多肽提供了更多的结合位点供钙离子进行螯合。继续增加多肽与钙离子的比例到3:1时，螯合率仍有提升但是趋势已经变缓，当肽钙比例超过3:1后螯合率反而略有下降，这是因为整个螯合体系的浓度偏高不利于金属离子与多肽结合成稳定的环状螯合结构，即螯合物不稳定。同时过量添加胶原多肽会造成原料的浪费。因此，选择肽钙比例2:1作为最佳配比。

2.4螯合时间对螯合效果的影响

  不同螯合时间对螯合效果的影响如图4所示。随着时间的延长，螯合率逐渐上升，初期上升较快，整体看在短时间内已经反应能够达到较高的螯合率这说明螯合反应是一个快速反应，当反应进行到40 min以后时，螯合率基本上已经没有明显的增长趋势，出于生产成本的考虑选择最佳螯合时间为40 min。

2.5正交试验优化螯合工艺结果

  根据单因素试验结果，选择对螯合影响较大的肽钙比例、pH和温度三因素设计正交试验，以肽钙比例2：1～4：1、pH 6～8和温度40℃～60℃为各因素的变化范围，选择L9(34)正交表设计正交试验。正交试验因素水平表如表1所示。

  利用L9(34)正交表建立的正交试验方案及试验结果见表2。

 从表2中R的分布可以看出对螯合程度的影响由大到小依次为pH>温度>肽钙比例，即pH对螯合效果的影响最大，其次是温度，肽钙比例的影响最小。从表3的K分布可知肽钙比例3:1、pH 7、温度50 0C条件下螯合率最高，对正交试验优化所得的螯合条件进行验证试验，该条件下螯合率(96.38%±0.12%)高于正交处理组中的最高值94.21%，所以最优螯合工艺为肽钙比例3:1、pH 7、温度50 0C和螯合时间30min。

2.6傅立叶红外光谱定性试验

  红外光谱以1 300 cm-1作为分界线分为2个不同的区域，大于1 300 cm-1区域的峰是官能团区，此区是由伸缩振动产生的吸收带，包括一般基团的特征吸收峰，该区域内吸收峰比较稀疏，是基团鉴定工作最有价值的区域。在1 300～600 cm-1的指纹区区域中，既包括单键的伸缩振动，又包括因变形振动产生的复杂光谱，分子结构稍有不同该区的吸收就要细微的差异，因此不易分辨。在胶原多肽溶液中主要是氨基酸残基之间的酰胺键，也有少量的末端或侧链氨基和羧基存在，因此在红外光谱中存在氨基的伸缩振动、变角振动和羧基的伸缩振动等吸收峰，而当胶原多肽与Ca2+螯合后，必然会引起其吸收峰位的偏移或变化，综合比较胶原多肽的红外光谱图5和胶原多肽螯合钙的红外光谱图6可以看出，-NH2的吸收峰由3 417.24cm-1移动到3 426.89 cm-1，C=O的吸收峰由1 654.60cm-1移动到1 652.69 cm-1，-COO-的吸收峰由1 407.28cm-1移动到1 419.35 cm-1，氨基、酰胺基与羧基氧都参与了反应，与钙离子形成配位螯合物，证明了螯合钙的生成。

2.7螯合物的紫外吸收光谱分析

 分别配制质量分数为4 mg/m L的胶原多肽以及胶原多肽螯合钙溶液，采用紫外可见分光光度计进行190—480 nm波长扫描，以蒸馏水为参比溶液测胶原多肽及其螯合物的光谱并绘制全波长扫描曲线。

 由图7的紫外吸收光谱图可以看出，胶原多肽螫合钙相对于胶原多肽在309，360和398 nm等几个主要的吸收峰均发生了波峰偏移，且吸光度也发生了相应的变化，说明胶原多肽与钙离子发生了螯合反应，产生了结构上的变化。

3结论

 1)制备胶原多肽螯合钙的最优螯合工艺为：肽钙比例3:1、pH 7、温度50℃、螯合时间30 min。

  2)对胶原多肽及其钙螯合物进行傅立叶变换红外光谱和紫外吸收扫描，结果表明，螯合前后胶原多肽及其钙螯合物在化学结构上发生了一定的变化，证明发生了螯合反应形成了胶原多肽的钙螯合物。