胡丹，刘畅，刘石生*
1．海南大学热带生物资源教育部重点实验室(海口570228)；2．海南大学食品学院（海口570228）
摘要 试验意在研究几种常见的单价盐及二价盐(Na Cl，Na2SO4，KC1，K2SO4，MgCl2和MgSO4)对橡胶籽中β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响情况，并对几种盐的作用效果进行了比较。试验结果表明，这几种盐均会降低声β-葡萄糖苷酶的热稳定性，且降低的程度依次为：MgCl2>Na Cl>MgSO4>K Cl>Na2SO4>K2SO4，并且盐类物质对β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响情况不仅与金属离子的化合价及种类有关，与其酸根离子的种类也有一定关系。
关键词β-葡萄糖苷酶；盐类；热稳定性
橡胶籽是橡胶工业的副产物，因为其毒氰苷含量较高而限制了它的开发利用，资源浪费达80%以上。有研究表明，橡胶籽中的内源β-葡萄糖苷酶含量丰富且活性极高，因此，研究其内源β-葡萄糖苷酶的性质，不仅可以提高橡胶籽资源的综合利用率，而且可以使其中的卢一葡萄糖苷酶推广应用于其它领域。
β-葡萄糖苷酶（β-Glycosidase）是一种水解酶，可以水解结合于葡萄糖末端、非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶在纤维素降解、食品增香及食物脱氰等方面均具有广泛的应用前景，但是由于酶不稳定而使其应用开发受到限制。温度是造成酶蛋白变性，从而使酶失活的最主要因素。而食品中的许多加工过程都涉及到温度的改变，且大多数的热变性都是不可逆的，因此，对酶的热稳定性进行研究是很有必要的。
许多食品在生产过程中都会添加盐类物质，尤其是食盐，在食品中有极为广泛的应用。但盐类物质对酶的热稳定性有何影响，目前报道较少。试验研究了常见的单价盐及二价盐对β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响，可以为食品加工中维持β-葡萄糖苷酶的酶活及热稳定性提供一定的参考价值。
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1原料
橡胶籽：海南八一农场。
1.1.2试剂
丙酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、盐酸、碳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁：分析纯，广州化学试剂厂；pNPG（4-硝基-β-吡喃葡萄糖苷）：分析纯，Sigma公司。
1.1.3仪器与设备
SPN300LF( 0.1 g)电子天平、EL303( 0.001 g)电子天平：梅特勒-托利多仪器常州有限公司；501数显水浴锅：金坛市富华仪器有限公司；FSH-II均质机：江苏金坛市环宇科学仪器厂；All basic小型粉碎机：IKA公司；TG16G离心机：尤尼柯上海仪器有限公司；7230G可见分光光度计：上海精科实业有限公司；SHB-IIIA循环水式多用真空泵：上海豫康科教仪器设备有限公司；PHS-3C精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；QL-902旋涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
1.2试验方法
1.2.1 β-葡萄糖苷酶粗酶液制备
橡胶籽去壳粉碎后，加入适量丙酮后抽滤制成干粉，在通风橱内平铺在纸面上，使丙酮完全挥发。取干粉加入蒸馏水均质后6 000 r/min离心20 min，取上清液加入丙酮沉淀后重新溶解，即得β-葡萄糖苷酶粗酶液，4℃保存备用。
1.2.2等电点沉淀
将β-葡萄糖苷酶粗酶液6 000 r/min离心10 min，取上清液，用0.1 mol/L盐酸调至溶液pH 5，室温下静置2h后8 000 r/min离心10 min，取上清液即得初步纯化的酶液，4℃保存备用。
1.2.3β-葡萄糖苷酶的活力测定
酶活力单位(U)定义：以对pNPG（硝基苯-β- D-葡萄糖苷）为底物，在一定分析反应条件下，1min生成1μmol对硝基苯酚所需要的酶量。
酶活力测定方法：向10 m L比色管中加入0.1 m L适当稀释的酶液或适当质量的固定化酶，同时加入0.3 m L pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液和0.1 m L 10 m mol/L p-NPG，42℃下水浴保温30 min，取出后立即加1 mo/L Na2C03终止其反应，加蒸馏水至5 m L，于400nm下测定吸光度。空白对照采用0.1 m L蒸馏水代替酶液进行操作。
1.2.4盐类物质对酶热稳定性的影响
取5 m L酶液于具塞试管中，分别添加不同质量浓度的氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾和硫酸镁，溶解后于60℃水浴加热1h后立即放人冰水冷却，并测定残余酶活。对照组为不加盐加热后的残余酶活。
残余酶活(%)定义为：在一定温度和热处理时间下，经过热处理后的酶活值相对于未进行热处理的酶活值的百分率。
2结果与分析
2.1 添加不同浓度的单价盐对β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响
2.1.1添加不同浓度的钠盐对β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响
Na Cl和Na2SO4对β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响如图1～2。
如图1所示，经60℃水浴加热1h后，添加Na Cl的β-葡萄糖苷酶溶液的残余酶活明显低于对照组。随着Na Cl浓度的不断增大，残余酶活逐渐下降，但下降速率逐渐减慢。当Na Cl浓度达到7%时，残余酶活已经接近于0。因此，向酶溶液中添加Na Cl会明显降低β-
葡萄糖苷酶的热稳定性。
由图2可以看出，添加Na2SO4以后，β-葡萄糖苷酶溶液的残余酶活仍低于对照组，因此，Na2S04会使β-葡萄糖苷酶的热稳定性有所下降，但下降幅度要比添加Na Cl的酶溶液的程度要小很多。且当Na2SO4的浓度达到1%时，残余酶活已经几乎不变，基本维持在32%上下，与对照组的残余酶活相比下降约17%。
2.1.2添加不同浓度的钾盐对β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响
KC1和K2SO4对β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响如图3～4。
由图3可见，添加KC1会大幅度降低β-葡萄糖苷酶的热稳定性，但效果略差于Na Cl。KCI的浓度达到19%时，残余酶活才接近于0。因此，添加氯化钾会明显降低β-葡萄糖苷酶的热稳定性。
如图4所示，在K2SO4的浓度小于3%时，残余酶活随着K2SO4的浓度的增大而降低；而当K2SO4的浓度达到5%时，残余酶活略有提高；当K2SO4的浓度达到9%以后，残余酶活基本不变，相比于对照组残余酶活只下降2.8%左右。由此可见，添加K2SO4对β-葡萄糖苷酶的热稳定性的影响较小。
2.2添加不同浓度的二价盐对β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响
2.2.1添加不同浓度的MgCl2对卢一葡萄糖苷酶热稳定性的影响
MgCl2对β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响见图5。由图5可以看出，加入MgCl2后，可以非常明显地降低3-葡萄糖苷酶的热稳定性。当MgCl2浓度小于2%时，残余酶活随着MgCl2浓度的增大而急剧降低；MgCl2浓度达到2%后，残余酶活已经几乎为0。由此可见，MgCl2对-葡萄糖苷酶热稳定性有较大影响，会显著降低其热稳定性。
2.2.2添加不同浓度的MgSO4对β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响
如图6所示，当MgSO4的浓度小于4%时，残余酶活随其浓度增大有较为明显的下降；当MgSO4的浓度继续增大时，残余酶活的下降趋势较为平缓；当MgSO4的浓度达到10%时，残余酶活接近于0。因此，加入MgSO4同样会使β-葡萄糖苷酶的热稳定性降低，但作用没有MgCl2明显。
3结论
根据以上试验的研究结果可以看出，加入盐类物质后，β-葡萄糖苷酶溶液加热后的残余酶活明显低于对照组。因此，盐类不仅不能作为β-葡萄糖苷酶的保护剂，反而会破坏酶的热稳定性。这几种盐对其热稳定性的破坏强度依次为：MgCl2>NaCl>MgSO4>KCl>Na2SO4>K2SO4。总体来说，二价金属盐的破坏强度要强于单价盐，单价盐中钠盐的破坏强度又强于钾盐，说明金属离子的破坏强度和其化合价及种类有关。与
此同时，在试验中，氯盐的破坏作用明显强于硫酸盐。这一结果说明，不仅金属离子会降低卢一葡萄糖苷酶的热稳定性，而且酸根离子也会其有不良影响，且不同的酸根离子影响程度不同。这与盐类对其它酶的影响规律并不完全相同。
当酶溶液受到加热作用时，酶分子会从一种有序的构象逐渐变为杂乱的构象，即发生酶变性。当酶发生变性后，酶的空间结构遭到破坏，导致活性中心的构象也发生变化，酶也因此而失活。当酶溶液中加入盐溶液后，可能由于盐的存在导致蛋白质的水化层遭到破坏，从而降低了β-葡萄糖苷酶的热稳定性。也有可能是因为加入盐类物质后，破坏了维持酶分子稳定的一些作用力，如氢键、疏水相互作用和静电相互作用等。但具体盐类物质是如何作用于β-葡萄糖苷酶的，还有待更进一步、更加深入的研究。
