徐阳，孙强，李静，冉旭*
( 四川大学食品科学与工程系(成都610065)
摘要 以大鲵胶原蛋白多肽粉为原料制得口服液，以感官评价和离心稳定性为指标，通过单因素和正交试验确定了口服液的最佳配方和杀菌条件。最佳配方为（质量分数）：大鲵胶原蛋白多肽粉1%、蔗糖10%、柠檬酸-0.3%、苹果汁2%、白葡萄汁2%、CMC-Na()．07%、黄原胶0.06%和果胶0.04%。杀菌条件为：110℃、0.04 M Pa和10min。并对制得的大鲵胶原蛋白多肽口服液进行急性毒性试验，对其安全性进行初步评价，口服液无急性毒性。
关键词 大鲵；胶原蛋白多肽；口服液；配方；杀菌工艺
大鲵又称娃娃鱼，是一种具有很高营养价值的两栖类动物，被誉为“水中人参”。大鲵皮肤中含有大量活性胶原蛋白。
目前，对大鲵的研究主要侧重于大鲵皮和肌肉等各个部位的营养成分的分析、提取及其功能性质的研究，而对大鲵进行精深加工的研究较少。目前大鲵多以鲜销餐饮为主，资源利用方式较单一。因此将其进行精深加工，开发成一种具有营养补充效果的多肽口服液，可提高产品附加值，增加其资源利用方式，从而促进大鲵产业的发展。叶欣等对大鲵皮胶原蛋白
肽的提取工艺进行了研究。
试验以大鲵胶原蛋白多肽粉为原料，开发一种口服液产品。重点对口服液配方及杀菌工艺进行研究，并采用SD大鼠经口急性毒理试验对其安全性进行初步评价，为其工业化生产提供理论基础。
1材料与方法
1.1材料
大鲵胶原蛋白多肽粉：参考叶欣等的方法在实验室用大鲵皮制得；风味蛋白酶（1.5万U/g）、中性蛋白酶（5万U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；蔗糖：食品级，上海市糖业烟酒有限公司；柠檬酸：食品级，山东潍坊英轩实业有限公司；黄原胶：山东中轩股份有限公司；耐酸型CMC-Na：上海华昌企业（集团）有限公司；明胶：河南省商水县富源明胶有限公司；果胶：郑州坤利食品添加剂有限公司；苹果汁、青葡萄果汁：市售；15 m L西林瓶：广州市番禺区沙湾鹏达玻璃钢制品厂；SPF级SD种大鼠：20只，雌雄各半，成都达硕生物科技有限公司，合格证号：SCXK（川）2013-24。
1.2主要仪器与设备
BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHP350电热培养箱：武汉瑞华仪器设备有限责任公司；JML-50多功能胶体磨：温州吴星机械设备制造有限公司；SW-CJ-1 FD单人单面净化工作台：中国苏净净化公司；pHS-3C酸度计：成都世纪方舟科技有限公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.3试验方法
1.3.1大鲵胶原蛋白多肽口服液加工工艺流程
1.3.2操作要点
1.3.2.1溶糖、溶酸
称取一定量的蔗糖，加入足量的纯净水配制质量分数为50%的糖浆。边加热边搅拌使蔗糖充分溶解，冷却后用400目的滤布过滤除杂。
称取一定量的柠檬酸，加入足量的纯净水配制质量分数为50%的酸溶液。搅拌使柠檬酸充分溶解，用400目的滤布过滤除杂。
1.3.2.2稳定剂溶液制备
配制质量分数为1%的稳定剂分散液。用胶体磨循环研磨分散液，使其充分分散成为均匀的胶体溶液。
1.3.2.3混合调配
按口服液总质量分数的1%称取大鲵胶原蛋白多肽粉，再按配方质量分数称取相应体积的糖浆、酸溶液、果汁和稳定剂胶体溶液，依次缓缓倒入酶解液中，最后加入纯净水，搅拌均匀。
1.3.2.4胶体磨、过滤
用胶体磨循环研磨2次，以得到均-稳定的口服液，胶体磨间隙为0.5 mm，用400目滤布过滤除杂。
1.3.2.5灌装
将所得的大鲵多肽口服液立即灌装至洁净的西林瓶中，封口。
1.3.2.6杀菌、冷却
将灌装好的口服液在一定条件下杀菌。将杀菌后的口服液分级冷却至室温，即得大鲵多肽口服液成品。
1.3.3 口服液配方优化
以感官评价为指标，通过预试验确定了大鲵胶原蛋白多肽粉、蔗糖、苹果汁、白葡萄汁和柠檬酸的较优添加量。参考GB/T 10789-2015“饮料通则”，蛋白饮料中蛋白质含量（质量分数）要求≥0.5%。而预试验感官评价结果表明，在大鲵胶原蛋白多肽粉添加量为1%时，口服液具有大鲵独特的风味，感官评分较高；多肽粉添加量过高则苦味增加，且易产生沉淀，影响口服液稳定性，成本也较高；添加量过低，大鲵独有的风味易被掩盖，感官评分较低。因此，大鲵胶原蛋白多肽粉的添加量定为1%，不再进行正交试验。剩下的4个因素则采用正交试验L9(34)进行优化，正交试验因素水平表如表1所示，表中数据为组分质量分数。
由10名具有食品专业知识背景的人对产品进行感官评价。感官评定标准如表2所示。
1.3.4稳定性加速试验方法
稳定性加速试验方法参照谷春梅等的方法，并略做修改：在刻度离心管中准确加入多肽口服液10m L，以4 000 r/min离心30 min，弃上层溶液，准确称取沉淀物质量（湿重），按公式(1)计算离心稳定性M，作为大鲵胶原蛋白多肽口服液稳定性评判指标。
1.3.5 复合稳定剂的选择及优化
由于口服液在调配过程中加入了柠檬酸，将其调配为酸性饮料(pH<4.6)，其中丰富的多肽会因为蛋白质-多酚聚合物的作用产生轻微絮凝。因此，需要通过添加稳定剂来提高口服液的稳定性。
在大鲵胶原蛋白多肽口服液中分别加入质量分数为0.1%的黄原胶、明胶、果胶和耐酸型羧甲基纤维素钠( CMC-Na)，通过加速试验考察4种稳定剂的稳定效果，选取效果较好的3种稳定剂做正交试验。
为了进一步提高口服液的稳定性，选取果胶、CMC-Na和黄原胶3种稳定剂进行两两复配预试验，发现稳定效果相对于单种稳定剂效果有了一定的提高，但还未达到所需效果。因此选取三种稳定剂进行复配，并根据预试验结果中三者的添加量水平，采用正交试验进行优化，正交试验表如表3。
1.3.6杀菌条件的选择
杀菌温度和杀菌时间是影响多肽口服液稳定性和感官品质的重要因素。试验表明，温度越高、压力越强、时间越长，口服液越容易发生美拉德反应，使得产品色泽变暗，影响产品感官质量。因此应在保证产品质量的前提下，杀菌温度越低、时间越短越好。
调配好的大鲵胶原蛋白多肽口服液pH在4.3以下，属于酸性蛋白饮料，有利于阻止微生物的生长。为了保证产品的杀菌效果，延长产品保质期，试验采用高温高压杀菌法，杀菌工艺设计方案如表4。将灌装好的口服液按表4中不同的杀菌方案进行杀菌，杀菌后在37 0C条件下贮藏7d，测定产品菌落总数、霉菌和酵母计数，并由感官评定小组对口服液进行感官评价，以“+”和“一”个数的多少表示感官质量的优劣，“+”越多，感官品质越好， “一”越多，感官品质越差。
1.3.7微生物指标测定方法
菌落总数参照GB 4789.2-2010测定。霉菌和酵母计数参照GB 4789.15-2010测定。
1.3.8经口急性毒性试验
参照GB 15193-2003食品安全国家标准“急性经口毒性试验”中最大耐受剂量法（最大耐受剂量MTD）：SD大鼠（体重180-220 g）20只，雌雄各半。设15g/kg BW为一个剂量组。准确称取大鲵胶原蛋白多肽口服液成品90 g，加蒸馏水至120 m L混悬，立即按2 m L/100 kg BW于动物空腹状态下一次性经口灌胃，灌胃后观察2周内死亡动物数量及一般健康情
况，根据最大耐受量判断口服液的急性毒性。
2结果与分析
2.1 口服液配方优化结果
大鲵胶原蛋白多肽口服液配方正交试验优化结果如表5所示，方差分析如表6所示。
由极差分析可知，各因素对口服液感官的影响顺序为蔗糖>柠檬酸>白葡萄汁>苹果汁。通过比较F比和F临界值可知，蔗糖和柠檬酸对口服液配方影响显著，而白葡萄汁影响较为显著，苹果汁无显著影响。同时由表5中K1、K2和K3可确定口服液最佳配方为A2B3C2D2，即按质量分数为蔗糖10%、柠檬酸0.3%、苹果汁2%和白葡萄汁2%。对最优配方进行验证试验，口服液呈均匀金黄色，酸甜适中，细腻柔和，具有大鲵特殊风味及水果香气，感官得分为96分。说明正交试验优化结果是可靠的，因此确定此配方为口服液最佳配方。
2.2复合稳定剂的配比优化
2.2.1 单一稳定剂的稳定效果
单一稳定剂在相同添加量（质量分-数0.1%）的条件下对口服液的稳定效果如表7所示，离心稳定性M越高，表明稳定剂稳定效果越好。
由表7可以看出，4种稳定剂对口服液的稳定性都起到了较好的作用。耐酸型CMC-Na效果最好，与其他3种稳定剂差异显著。单一稳定剂对口服液稳定效果的影响顺序为CMC-Na>果胶>黄原胶>明胶，因此，选定CMC-Na、果胶和黄原胶进行正交试验。
2.2.2复合稳定剂正交试验结果
大鲵多肽口服液复合稳定剂正交试验结果如表8所示，方差分析如表9所示。
由表8极差分析R可知，各因素对口服液感官品质的影响顺序为CMC-Na>黄原胶>果胶，同时由表中K1，K2，K3值可确定稳定剂最佳配方为A2B3C ，即CMC-Na 0.07%、黄原胶0.06%和果胶0.06%。由表9中F比和F临界值的比较可知，CMC-Na在0.05%水平下对复合稳定剂配方影响显著，而黄原胶和果胶无显著影响，与极差分析结果一致。对最佳复合稳定剂配方进行验证试验，其离心稳定性为99.59%，这与3号试验配方稳定性大致相同，但相较之下，3号试验配方的感官评价更高，这是由于过多的稳定剂影响了口服液口感，因此选用3号配方作为多肽口服液复合稳定剂配方，即按质量分数添加CMC-Na 0.07%、黄原胶0.06%和果胶0.04%。
2.3杀菌条件的选择
不同杀菌条件的杀菌结果如表10所示。由表10可知，除在105℃下杀菌5 min、10 min和1 10℃下杀菌5 min不能满足微生物指标外，其他杀菌条件都达到了卫生要求。但随着杀菌温度的升高，多肽口服液色泽明显变暗，感官质量也明显降低。由表10可知，杀菌条件为110℃、10 min时，微生物指标达到要求，且感官质量较好。因此，最终确定多肽口服液杀菌条件为110℃、0.04 M Pa和10 min；
2.4经口急性毒性试验结果
大鲵胶原蛋白多肽口服液15 g／kg BW剂量经口染毒后，未见中毒症状或不良反应，2周内未见动物死亡，体重增长正常，试验结果见表11。动物解剖内脏器官未见异常改变。即大鲵胶原蛋白多肽口服液对雌、雄性SD大鼠的急性经口MTD均大于15 g/kg BW，无急性毒性。
3结论
在单因素试验基础上，采用正交试验，以感官评价得分和离心稳定性为指标，优化了口服液配方，并最终确定配方（质量分数）：大鲵胶原蛋白多肽粉1%、蔗糖10%、柠檬酸0.3%、苹果汁2%、白葡萄汁2%、CMC-Na 0.07%、黄原胶0.06%和果胶0.04%。
采用单因素试验的方法，以感官质量和微生物数量为指标，确定了口服液杀菌条件：110℃、0.04M Pa和10 min。在此杀菌条件下，口服液既能满足杀菌要求，又较好地保持了口服液的感官质量。
通过对大鲵胶原蛋白多肽口服液进行急性毒性试验，对其安全性进行了初步评价。结果显示，在大鲵多肽口服液的最大耐受剂量试验中，SD大鼠未见异常，2周内无死亡，说明口服液无急性毒性。
