贾爱荣1，3，张永刚z，3，夏雪奎2，3，刘新1,3，张绵松2,3，刘昌衡1，3
1．山东省科学院生物研究所（济南250014）；2．山东省科学院生态研究所（济南250014）；
3．山东省应用微生物重点实验室（济南250014）
摘要探讨了不同包装方式（对照 CK、空气包装AP、真空包装VP）的中国明对虾在40C贮藏过程中腐败微生物的变化规律，以及天然提取物对优势腐败菌和中国明对虾货架期的影响。结果表明，与CK组及AP组分别在4 d和5 d到达货架期终点相比，VP组无论是在感官水平还是微生物含量上都是在8 d达到货架期终点。菌相分析表明，气单胞菌为AP组的优势腐败菌，而此菌在Ⅵ，组中得到了显著抑制(p<o．05)，在货架期终点时，乳杆菌成为VP组的优势腐败茵。另外无论何种包装方式，假单胞菌都是中国明对虾的主要腐败菌。天然提取物中的茶多酚和厚朴酚，对假单胞菌具有明显的抑制效力，在质量浓度为20 mg/mL时，抑茵直径分别为24 mn和16 mm。茶多酚可明显延长中国明对虾货架期，使其在7d达到货架期终点，比CK延长了3d。
关键词 中国明对虾：腐败微生物：贷架期；真空包装；天然提取物
Effects of Different Approaches on Spoilage Microorganisms in Chinese
Shrimp (Fenneropenaeus chinensis) during Storage
Jia Ai_rongl'3, Zhang Yong-gang2,3, Xia Xue-kui2,3, Liu Xin1,3, Zhang Mian-song2,3, Liu Chang-hengl,3
1. Biology Institute of Shandong Academy of Sciences (Jinan 250014); 2. Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences (Jinan 250014); 3. Key Laboratory for Applied Microbiology of Shandong Province (Jinan 250014)
Abstract Discuss the effect of air (AP) and vacuum packaging (VP) on spoilage microorganisms in Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis) at 4℃ during storage, as well as the influence ofnatural extracts on dominant spoilage microorganisms and the shelf life of Chinese shrimp. The results show that, compared with CK and AP, which reached the shelf life on the fourth and fifth days separately, the VP reached the end of shelf life on the eighth day no matter senses or microbial concentration. The microflora analysis indicated that, Aeromonas spp. was dominant microorganisms in AP, whereas growth of the specie was inhibited under VP condition significantly (p<0.05). Lactobacillus spp. became dominant spoilage microorganisms on VP at the end of shelf life. Pseudomonas spp. was the main spoilage microorganisms in Chinese shrimp no matter what kind of packaging. Tea polyphenols and magnolol has obvious inhibiting effect on Pseudomonas spp. The inhibition zone diameters can reach 24 mm and 16 mm on the concentration of 20 mg/mL respectively. Compare with CK, tea polyphenols can prolong 3 d of the shelf life of Chinese shrimp, which makes the shelf life to the end on the seventh day.
KeywordsFenneropenaeus chinensis; spoilage microorganism; shelf life; vacuum package; natural extracts
中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）等新鲜水产品肌肉中水分含量高、组织脆弱、天然免疫物质少、不饱和脂肪酸易氧化以及可溶性蛋白质含量高，因此比一般的动物肉组织更容易腐败。探求导致水产品变质的微生物种类，才能有效进行品质变化的监控和产品腐败的靶向抑制，是研发加工保藏技术、提高水产品质量的前提⑴。国内外已对水产品中的微生物活动进行了长期研究，并从海产品中分离得到了常见的腐败菌，如假单胞菌、气单胞菌、肠杆菌、弧菌、乳酸菌、芽孢杆菌、发光杆菌、莫氏杆菌、不动杆菌和黄杆菌等⑵。研究表明大多数情况下，水产品所含微生物只有部分微生物参与了腐败过程。水产品腐败主要表现在某些微生物生长和代谢生成胺、硫化物、醛、酮、酯和有机酸等，产生不良气味和味道，使产品感官上不可接受，品质改变⑶。由于所使用的原料、加工方法和产品的贮藏条件不
同，水产食品中存在不同菌相。在有氧冷藏中，来源于不同水域的鱼、贝类和甲壳类的特定腐败菌多为假单胞菌（Pseudomonas spp.）或者腐败希瓦氏茵（Shewanella putrefaciens）[4-5]。曹荣发现太平洋牡蛎在00C，5℃和10 0C条件下冷藏，优势腐败菌都是假单胞菌⑹。朱天祥等报道4 0C冷藏冰鲜大黄鱼5d后假单胞菌为优势腐败菌（占65.1%）⑺。徐丽敏等发现4
oC冷藏中国明对虾的优势腐败菌是假单胞菌与气单胞菌（Aeromonas spp.）[8】。
特定腐败菌与产品剩余货架期之间存在密切关系，可以依据特定腐败菌初始数和生长模型来预测产品的剩余货架期。例如欧盟项目“鱼类鲜度评定”中，建立了磷发光杆菌、腐败希瓦氏菌和假单胞菌属的生长动态模型，成功地用于预测有氧和真空、气调包装冷链水产鲜品的剩余货架期，这些模型已开发出专家系统软件。针对特定腐败菌的生物学特性，采用
靶向抑制或降低特定腐败菌生长的处理和加工方法，可以延长产品货架期。
食品防腐剂是防止食品腐烂变质的重要手段之一。目前，食品工业采用的防腐剂包括天然防腐剂和化学合成防腐剂两大类。但长期的研究表明，化学合成防腐剂存在致癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题，影响着食品安全。而天然防腐剂不但对人体健康无害或低害，而且防腐效果完全可以与化学防腐剂相媲美9。随着人们对食品安全性与环保问题的日益重
视，选择从植物中寻找和提取广谱、高效、低毒、多功能的防腐剂成为当前天然食品防腐剂研究的一大潮流。
根据中国明对虾特定腐败菌的生物学特性，靶向抑制或降低其生长，以期研制绿色环保的新型保鲜剂与相应的贮藏方法，延长产品货架期，提高产品价值。
1 材料与方法
1.1材料
鲜活中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）：规格为50—60尾/kg，市售。保活运回实验室，剔除残缺及失活的个体，经流水清洗后无菌冰水使虾猝死，待用。
革兰氏染色液；VRBGA培养基、MRS琼脂培养基、Pseudomonads琼脂培养基、Aeromonas isolation琼；旨培养基、PCA培养基、TSA培养基。鞣花酸、绿原酸、厚朴酚、多酚、茶多酚：西安天一生物技术有限公司。
HBM-400B拍击式均质器：天津市恒奥科技发展有限公司；D2-600/2SD型真空包装机：青岛麦格；D2-300A多功能真空封装机：温州市凯驰包装机械有限公司；YXQ-LS-60立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DNP-9082型电热恒温培养箱、DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；YT-1300超净工作台：北京亚泰科隆；80i生物显微镜：日本尼康；AL204分析天平：瑞士梅特勒。
1.2试验方法
1.2.1 中国明对虾的包装及贮藏
将中国明对虾样品随机分成3组，一组为对照(CK)，不进行任何包装处理，另外2组进行不同的复装处理，其中第一组空气包装( AP)，第二组真空 包装(VP)，随后将样品放入4℃中贮藏，每天取样进行腐败微生物及感官分析，每个处理3个重复。
1.2.2腐败微生物分析
每天定时取样，对贮藏过程中的中国明对虾样品进行微生物分析。在无菌条件下准确称取25 g样品，无菌剪刀剪至0.5 cm左右，放入无菌袋内，加入225 mL生理盐水，然后于均质器上均质，即成10-1的稀释液。然后依次10倍比稀释，选择合适的浓度涂布平板。
1.2.2.1细菌总数测定
根据食品安全国家标准GB 4789.2-2010“食品卫生微生物学检验菌落总数测定”采用PCA对菌落总数进行测定。
1.2.2.2假单胞菌属的测定
先将Pseudomonads琼脂培养基高压灭菌，倒入培养皿，待其凝固后，加入0.1 mL菌悬液，涂布后置于28℃恒温培养箱中倒置培养48 h。
1.2.2.3气单胞菌属的测定
先制备Aeromonas isolation琼脂培养基培养皿，加入0.1 mL菌悬液，涂布后置于28℃恒温培养箱中倒置培养48 h。
1.2.2.4乳酸菌属的测定
向空培养皿中加入1 mL菌悬液，然后倒入MRS琼脂培养基，混匀。凝固后置于28℃的恒温培养箱中倒置培养48 h。
1.2.2.5肠杆菌科的测定
向空培养皿中加入1 mL菌悬液，然后倒入VRBGA培养基，混匀。凝固后置于37℃的恒温培养箱中倒置培养48 h。
其中，每个处理均做3个重复，菌悬液每个稀释度倒3个培养皿，试验数据采用SPSS 13.0软件进行分析均数、标准差及显著性差异，差异显著性水平设置为p<0.05。另外，在试验过程中，随机选择培养皿中的菌落进行革兰氏染色和镜检来检查每个培养基的选择性。
1.2.3感官分析
制定适合中国明对虾气味、虾壳外观及虾肉外观描述的参考标准（表1），以10分制计。其中，在气味方面，1代表生鲜味淡、陈腐味浓重；10代表无腐味、生鲜味浓。在虾壳外观上，l代表褐变严重、无光泽、黑斑多、颜色暗；10代表无褐变、光泽明亮、无黑斑、颜色鲜亮。在虾肉外观上，1代表虾肉扁平、褐变严重；10代表虾肉饱满、无褐变[10-11]。
1.2.4天然生物保鲜剂的抑菌效果
1.2.4.1 牛津杯法测定抑菌效果[12]
针对引起腐败变质的优势菌——假单胞菌进行抑菌作用研究。过夜培养的菌体浓度约为l09 CFU/mL，取50 μL加入到50 mL LB液体培养基中，振荡培养30 min使菌体混合均匀后进行试验，浓度约为l06 CFU/mL。每培养皿内倒人15 mL LB固体培养基，待培养基凝固后，取100μL浓度约为l06 CFU/mL的菌液均匀涂布，设3个重复。每个培养皿中放置3个牛津杯(直径6 mm)为3个梯度，加入抑菌剂100 μL。37℃培养24 h后，测量抑菌圈，计算平均值，进行对比研究。
1.2.4.2最低抑菌浓度(MIC)测定[13]。
采用双倍试管稀释法测定MIC。取10支编号无菌试管，均加入5 mL LB液体培养基。向1号试管中加入质量浓度为20 mg/mL的抑菌剂5 mL，混匀后，吸取5 mL到2号管中依次类推，最后从8号管中吸取5 mL丢弃。将8只试管中均加入l06 CFU/mL菌液0.5 mL，第9
管为不含抑制剂只含等量菌液的对照管，第10管为不含菌液不含抑制剂的阴性对照管。充分混匀后置恒温振荡培养箱中37℃培养12 h观察结果，以无菌生长的抑制剂最高稀释管中的抑制剂浓度为该抑制剂对致病菌的的最小抑菌浓度( MIC)。
1.2.5天然生物保鲜剂对中国明对虾货架期的影响
将鲜活中国明对虾按1.1的方式处理，然后分两组，一组喷洒茶多酚，另外一组喷洒双蒸水作为对照。不进行任何包装处理，放入4℃中贮藏，每天取样进行菌落总数检测，每个处理3个重复。
2结果与分析
2.1不同包装方式中国明对虾在贮藏过程中微生物变
化情况
一般来说，对虾细菌总数≤lo5 CFU．g-1一级鲜度，细菌总数≤5×l05 CFU．g-1为二级鲜度，细菌总数达到l06 CFU．g-1时通常虾已腐败不能食用，此时可断定为货架期终点[14]。如图1 (a)所示，在4℃贮藏初期，细菌总数有一定程度的降低，这可能与部分不耐冷细菌死亡有关，之后细菌总数明显增加，其中CK组、AP组、VP组的细菌总数分别在4，5和8d时超出了l06 CFU．g-1在贮藏过程中，VP组细菌总数显著低于AP组(p<0.05)和CK组(P<0.05)。
假单胞菌是水产类食品的特定腐败菌。由图1(b)可知，假单胞菌在中国明对虾的初始菌量达到2.10 log CFU．g-1，在检测的微生物中所占比例最大，说明初始菌相中优势菌为假单胞菌。中国明对虾贮藏初期(1~2 d)，假单胞菌在CK、AP、VP组的变化差异并不显著(p>0.05)，2 d后，相比CK与AP组，VP组假单胞菌明显受到抑制(p<0.05)。但无论何种包装方式，在货架期终点假单胞菌都是中国明对虾的主要腐败菌。
气单胞菌在贮藏过程中随着时间延长而明显增长，气单胞菌逐渐成为AP组的优势菌属，菌落数已达到5.40 log CFU．g-1(5d)。而相比于AP组，VP组的气单胞菌从3d开始得到了显著抑制(p<0.05)，最后达到5.52 log CFU．g-l(8 d)。
肠杆菌科是兼性厌氧菌，好氧条件更适合它的生长。由图1 (d)可见，新鲜中国明对虾的肠杆菌在初始菌相中所占比例较小( 1.60 log CFU．g-l)，相比CK与AP组，VP组的肠杆菌从2d开始便得到了显著抑制(p<0.05)。
乳杆菌是一种致腐能力较弱的兼性厌氧菌。由图1 (e)可见．中国明对虾中乳杆菌的初始菌数为1.65log CFU．g-1，所占比例相对较小。贮藏末期的AP组乳杆菌数量为4.26 log CFU．g-l (5 d)，而VP组在8 d，乳杆菌数量上升至5.98 log CFU．g-1，与AP及CK组相比，已显著占据了VP组中腐败菌组成的绝大比例(p<0.05)，成为VP组腐败菌相中的优势菌，这与乳杆菌的兼性厌氧有关。
2.2不同包装方式中国明对在虾贮藏过程中感官变化
情况
不同包装方式的中国明对虾在贮藏过程中感官变化结果见图2。在贮藏初期(0d)，中国明对虾的感官得分分别为气味9.65，虾壳外观9.26及虾肉外观9.58。但随着贮藏时间的延长，各组的气味及外观的可接受分值均呈下降趋势。气味指标中，CK组(4d)、AP组(5 d)得分分别下降到5.81，5.61，并且带有难闻的陈腐味，已不可食用；VP组在5d仍处于可接受状态，得分为6.98。外观指标方面，CK组(4d)及AP组(5d)除部分腹节尚未出现褐变外，尾节已完全褐变，并且腹节连接处带有黑斑，虾肉颜色也较暗淡。而VP组无论虾壳还是虾肉，颜色均很明亮，仍接近于新鲜时期的对虾。但是由于厌氧微生物的作用，以及蛋白质等营养物质的分解，影响了虾肉外观的色泽。因此尽管虾的外观尚未出现褐变，VP组仍然
于第8天进入感官拒绝期。
CK组、AP组、VP组在第4，第5和第8天综合得分分别5.42，5.38和5.44，进入感官拒绝期。对于VP组来说，真空状态不仅能够降低对虾氧化褐变，而且需氧菌的生长繁殖也能够得到有效抑制，因此，VP组的货架期明显长于AP组。
2.3天然生物保鲜剂的抑菌作用
2．3.1 牛津杯法测定抑菌效果
针对引起水产品腐败变质的优势菌——假单胞菌进行抑菌作用研究，采用天然植物提取物作为抑菌剂，以期开发新的食品保鲜剂。
试验中使用的天然提取产物，一般都具有抗氧化、抗衰老、抗癌变、抗辐射、防腐保鲜、抑菌等功能[15]。而在食品贮藏保鲜中的应用，实际上就是利用其良好的抗氧化和抑菌的功效，作为保鲜剂、保色剂，抑菌剂，以延长食品货架期。
如表2所示，5种天然提取物对假单胞菌都有抑制作用，其中茶多酚和厚朴酚的抑菌效果最为明显，20mg/mL的抑菌直径分别为24 mm．16 mm。
2.3.2最低抑菌浓度(MIC)测定
根据测定结果，茶多酚的抑菌效果最佳，因而测定茶多酚对假单胞菌的最低抑菌浓度，结果为0.313 mg/mL。
2.4茶多酚对中国明对虾菌落总数的影响
从包装方式对中国明对虾贮藏影响的结果可以看出，菌落总数的变化与感官变化、腐败菌增长趋势基本一致。因而，在研究保鲜剂对中国明对虾贮藏影响中，只考虑了菌落总数的变化情况。
根据茶多酚最低抑菌浓度结果，使用0.3%茶多酚处理样品。在4℃下贮藏的中国明对虾中菌落总数的变化如图3所示，经过0.3%茶多酚喷洒过的中国明对虾，在第7天菌落总数超过6 log CFU．g-1，其上升趋势也比较平缓，说明茶多酚有一定的抗菌活性。
3结论
通过采用不同包装方式表明，真空包装可明显延长中国明对虾的保鲜期，无论是在感官水平还是微生物含量上都是在8d达到货架期终点。天然提取物中的茶多酚和厚朴酚，对引起水产品腐败变质的优势菌——假单胞菌具有明显的抑制效果，在质量浓度为20 mg/mL时，对其抑菌直径分别为24 mm和16 mm无包装状态下，喷洒茶多酚，可明显延长中国明对虾的货架期，使其在7d达到货架期终点。通过采用靶向抑制或降低特定腐败菌生长的处理和加工方法，可以延长产品货架期。然而延长中国明对虾的货架期不仅包括原辅料的选择及预处理，保鲜剂的使用及包装方式的选择，更是一个系统管理过程，研究各栅栏因子的复合作用技术将是未来发展的主要趋势。
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