分散固相萃取一气相色谱测定土壤中有机磷农药

 张丽，  刘腾飞，  杨代凤，  邓金花，  董明辉

  (1．苏州市职业大学教育与人文学院，江苏苏州215104; 2.江苏太湖地区农业科学研究所，江苏苏州215155)

  摘要：为准确、简便地测定土壤中的乐果、毒死蜱、杀螟硫磷及三唑磷残留量，采用分散固相萃取净化，建立了气相色谱法测定土壤中这4种有机磷农药残留的分析方法。样品经水浸润后，冰乙酸一乙腈（V：V=1:99）溶液超声提取，适量乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和十八烷基硅烷键合硅胶(C18)吸附剂净化提取液，GC/FPD测定，基质外标法定量。在优化条件下，乐果和三唑磷的线性范围为0.04~4.0 mg/L,毒死蜱和杀螟硫磷的线性范围为0.02~2.0 mg/L,相关系数r均大于0.998。在0.05~1.0 mg/kg添加水平范围内，4种农药的平均回收率在83.3%~96.6%之间，相对标准偏差(RSD,n=3)为1.3%~9.4%，检出限(S/N>3)为0.007 7~0.022 mg/kg，定量限(S/N >10)为0.026~0.072 mg/kg。该方法操作简单、结果准确、有机试剂用量少、分析成本低，适用于土壤中有机磷农药的残留检测与分析。

 关键词：分散固相萃取；气相色谱；土壤；有机磷农药；残留分析

 中图分类号：X833 文献标志码：A doi:  10.3969/j .issn,1003-6504.2015 .10.025 文章编号：1003-6504(2015)10-0134-06

 Determination of Organophosphorus Pesticides in Soil by Gas

 Chromatography with Dispersive Solid Phase Extraction

 ZHANG Li,  LIU Tengfei,  YANG Daifeng,  DENG Jinhua,  DONG Minghui

 (l.College of Education and Humanity, Suzhou Vocational University, Suzhou 215104, China;2.Jiangsu Taihu Regional Institute of Agricultural Science, Suzhou 215155, China)

Abstract: To determine residues of dimethoate, chlorpyrifos, fenitrothion and triazophos in soil accurately andconveniently,a rapid analytical method based on the modified dispersive solid phase extraction (DSPE) for sample preparation and gas chromatography was established. Sample of soil was extracted with glacial acetic acid acetonitrile solution after water soaking by ultrasound assistance, the extracts were cleaned-up by using primary secondary amine  (PSA) and octadecylsilane bonded silica  (C18) as adsorbents according to the method of DSPE, then determined by GC/FPD and quantified by using matrix-matched external standard method. Under the optimized conditions, good linearities were obtainedin the concentrations of 0.04~4.0 mg/L for dimethoate and triazophos and 0.02~2.0 mg/L for chlorpyrifos and fenitrothion,with correlation coefficients higher than 0.998. The mean recoveries of four analytes in soil ranged from 83.3% t0 96.6% atfortified levels of 0.05~1.0 mg/kg with relative standard deviation(RSD, n=3) of l.3%~9.4%,with limits of detection (LOD,S/N>3) ranged from 0.0077 t0 0.022 mg/kg and the limits of quantification (LOQ, S/N >10) ranged from 0.026 t0 0.072 mg/kg. The method is simple, accurate, solvent saving and low at cost, which is suitable for determination and analysis of organophosphorus pesticides in soil.

Key words: dispersive solid phase extraction; gas chromatography; soil; organophosphorus pesticides; residue analysis

 有机磷农药(organophosphorus pesticides．OPPs)是一类广谱、高效的杀虫剂，广泛应用在农业害虫和卫生害虫的防治上，品种多、毒力强、残留期短、价格低廉，是化学防治最常用的选择。OPPs在杀虫剂中占据重要的地位，至今仍是世界上生产和使用最多的农药品种，在我国，OPPs占农药使用总量的70%以上。尽管OPPs多数品种属于非持久性农药，但由于它们对胆碱酯酶的抑制，对人体和哺乳类动物存在着急性中毒的危险，常因使用、保管等不慎，以及食用被污染食物，发生中毒。而且在作物种植过程中，由于施药器械、施药方式和技术等因素，施用的OPPs仅有很少部分作用在靶标生物上，大部分经迁移转化，残留于土壤等环境介质中，造成土壤农药的污染，并通过径流、淋溶等途径，造成地表水、饮用水源的污染，因此准确地测定土壤中OPPs对保护土壤环境和人畜健康具有重要意义。

 土壤干扰物质较多，复杂的基体成分容易对OPPs的分析产生干扰，因此选择合适的前处理方法是土壤OPPs检测的首要关键步骤。目前，土壤样品中OPPs的残留分析，采用的样品提取技术主要为传统的索氏提取法、机械振荡法和加速溶剂萃取法，净化手段有液液分配净化、柱层析净化和固相萃取净化，也有采用凝胶渗透色谱净化，这些方法虽然提取净化效果好，但普遍存在溶剂用量大、样品通量小、操作复杂、耗时长、材料成本高等不足，有的萃取过程需要在高温下进行，容易造成热不稳定OPPs的分解，还有些需要昂贵的萃取仪器，运行成本高，难以在普通实验室推广使用。分散固相萃取(dispersive solid phase extraction，DSPE)是由美国农业部Anastassiades M等于2003年开发的一种用于农药多残留检测的快速样品前处理技术，该方法利用在样品提取液中充分涡旋的分散吸附填料，将基质中的色素、脂肪、糖类、有机酸等杂质成分除去，从而实现复杂样品中的农药多残留快速、高效、经济的测定。而且该方法灵活性强，可以根据样品基质和目标分析物的特点，选择合适的提取溶剂和吸附填料，以适应不同样品基质的提取净化需要，目前已广泛用于水果、蔬菜的农药残留检测，但在土壤中的应用报道较少。本研究对DSPE进行适当改进，用于土壤样品前处理过程，结合气相色谱法( GCIFPD)检测，建立了土壤样品中乐果、毒死蜱、杀螟硫磷、三唑磷4种OPPs的定量检测方法，并对方法的准确度、精密度和灵敏度等进行了研究。

1材料与方法

1.1仪器与设备

 7890A气相色谱仪，配有火焰光度检测器(FPD)、7693自动进样器和Chemstation色谱工作站（美国Agilent公司）；KQ-500 DE数控超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）；TG16-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HSC -24B氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）；VM-10涡旋振荡器（韩国Daihan Scientific公司）；SX2-4-10马弗炉（上海跃进医疗器械有限公司）；Direct-Q5 UV型超绅水机（美国Millipore公司）。

1.2  药品与试剂

 乐果、毒死蜱、杀螟硫磷、三唑磷标准品，质量浓度均为1 000 mg/L，购于农业部环境保护科研监测所；丙酮，HPLC级（上海国药集团化学试剂有限公司）：乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)，40～60 μm（美国AgelaTechnologies公司）；十八烷基硅烷键合硅胶(Cl8)，40~60 μm(美国Sepax Technologies公司)；乙腈、丙酮、冰乙酸、无水乙酸钠、无水硫酸镁（500℃灼烧5h）均为分析纯（上海国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为超纯水(18.4 MΩ)。

1.3供试土壤

 供试土壤为黄壤土，取自苏州市东山某茶园，采样深度为0~15 cm。将土样除去草根、石块等杂物，人工捣碎，在盆或其他适宜容器中充分混合均匀，用四分法取一定量备用，制备好的土壤样品应尽快分析，否则放人-20℃冰箱中保存。

1.4试验方法

1.4.1样品前处理

 提取方法：准确称取5.0 g土壤样品，置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入2 mL超纯水，涡旋混匀，浸润15 min，加入10 mL冰乙酸一乙腈(1:99，V/V)溶液，混匀，超声提取10 min，加入2g无水乙酸钠和2g无水硫酸镁，涡旋2 min，以9 000 r/min转速离心4 min，取上清液待用。

 净化方法：另取一支10 mL聚四氟乙烯离心管，加入0.15 g C18、0.15 g PSA和0.3 g无水硫酸镁，加入4 mL上述待净化的提取液，涡旋2 min，以9 000r/min转速离心5 min。移取2.0 mL上清液，在50℃水浴下用氮气缓慢吹至近干，定量加入l mL丙酮溶解，过0.22 μm有机系滤膜，上机测定。

1.4.2仪器条件

 色谱柱：DB-1701(30 mx0.32 mmx0.25μm)：FPD温度：245℃；进样口温度：220℃，隔垫吹扫3mL/min；柱温：初始温度90℃，保持l min，20℃/min升至200℃，保持9 min，30℃/min升至245℃，保持8 min:载气：高纯氮气，纯度≥99.999%；恒流模式，流速3 mL/min；氢气：75 mL/min；空气：100 mL/min;尾吹气：高纯氮气，60 mL/min;进样量：1.0 μL，不分流进样。

1.4.3线性试验

 分别移取1 000 mg/L乐果、毒死蜱、杀螟硫磷；三唑磷标准品1 mL置于10 mL容量瓶中，用丙酮定容，配成质量浓度为100 mg/L的单标溶液。根据各农药在FPD检测器上的响应，取乐果、三唑磷单标溶液各2 mL，毒死蜱、杀螟硫磷各lmL于10 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，得混合标准储备液，保存于4℃冰箱中。取空白土壤试样，按照1.4.1节步骤处理，用其提取液作为溶剂，配制乐果、三唑磷质量浓度分别为0.04、0.1、0.2、1.0、2.0、4.0 mg/L及毒死蜱、杀螟硫磷质量浓度分别为0.02、0,05、0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L的基质匹配系列标准溶液，按照1.4.2节色谱条件测定。以标准溶液的质量浓度(p)为横坐标，峰面积响应值(y)为纵坐标，绘制基质标准曲线。

  1.4.4添加回收试验

 称取5.0 g空白土壤样品3份，分别加入25、50、250 μL l.4.3节中4种农药混合标准储备液，其中乐果、三唑磷的添加水平分别相当于1.0、0.2、0.1 mg/kg，毒死蜱、杀螟硫磷相当于0.5、0.1、0.05 mg/kg，充分混匀，静置th，按照1.4.1节提取与净化方法和1.4.2节色谱条件测定，对每个添加水平作3个平行，考察方法的准确度和精密度。

  1.4.5定性和定量

 准确吸取1.0 μ1样品溶液进样，记录色谱峰保留时间和峰面积。再吸取1.0 μL基质混合标准溶液进样，记录保留时间和峰面积，以保留时间定性，基质外标法定量。定量计算公式：ω=(pxvxf )/m，式中ω为样品中待测农药残留量（mg/kg），p为测定值(mg/L)，m为称取的样品量(g)，v为定容体积(mL)，f为稀释倍数。

  2结果与分析

  2.1提取条件的选择

 土壤含水量少，提取前在5.0 g土壤中加入2mL超纯水浸润，能够增大样品的孔径，易于提取溶剂的渗入，增加提取效率。OPPs属极性化合物，较易溶解于丙酮、乙腈、二氯甲烷，以及一定比例的混合溶剂。文献中一般使用丙酮、乙腈、丙酮一正己烷、丙酮一二氯甲烷等提取土壤中OPPs残留。由于OPPs具有弱酸性，在酸性条件下较稳定，本研究对比了土壤添加样分别采用丙酮、乙腈以及冰乙酸一乙腈（V：V=1:99）提取的效果。结果显示（表1），丙酮、乙腈以及冰乙酸一乙腈（V：V=1:99）对4种农药的提取效率相当，但是选用丙酮作为提取溶剂时，提取的色素类杂质较多，提取液颜色较深，增加了后续净化的难度；以乙腈和冰乙酸一乙腈（V：V=1:99）作为提取溶剂时，提取液颜色较浅，且互相接近，与乙腈相比，冰乙酸一乙腈（V：V=1:99）提取的基质干扰物较少，且基质效应相对较小，因此本试验在土壤样品中加水浸润后，选择冰乙酸一乙腈（V:V=1:99）作为提取溶剂进行提取。同时，确定提取溶剂用量为10 mL，即体积相当于2倍样品质量，既能保证农药的充分提取，又节省试剂，减少环境污染。

 超声波提取法操作简单，所需时间短，可实现批量样品的同时处理，因此试验中采用超声波提取方式，以提高提取效率。由于超声波在提取过程中会产生热量，过长的超声时间可能会造成OPPs的分解，降低灵敏度，影响回收率，因此考察了5、10、15、20 min的超声时间对土壤加标样的提取效果，结果见图l。由图1可知超声时间为10~20 min时4种农药的回收率相对较高，均在86%以上，且平行性较好，为节省前处理时间，选择超声时间为10 min。提取过程中，加入无水乙酸钠作为盐析剂，使得水与乙腈分层，无水硫酸镁用于吸取有机层中的水分。

2.2净化条件的选择

 利用超声波溶剂提取土壤样品中的菊酯类农药时，同时会将基质中存在的色素、甾醇、脂肪酸，油类、蜡类等杂质一起提取出来，干扰气相色谱仪对待测组分的分离和测定，污染检测仪器，所以必须进行除杂净化处理。本试验采用DSPE吸附杂质和净化样品。DSPE常用的吸附剂主要有乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)和石墨化碳黑(GCB)。PSA吸附剂的硅胶表面键合极性官能团（氨基），该官能团为其有效成分，它能从样品中吸附极性化合物，对于样品中的一些强极性杂质，有机酸、糖类、色素和金属离子（与金属离子产生螯合作用）等具有良好的净化作用。PSA为正相硅胶键合吸附剂，含水量越少净化效果越好；C18为反相硅胶键合吸附剂，其硅胶基质上接有十八烷基，有较高的相覆盖率和碳含量，对非极性物质有较高的容量，特别对油脂的去除有十分显著的效果，同时还可以除去甾醇、弱极性色素和其它非极性干扰物，且对目标物的吸附性不强；GCB是碳黑在惰性气体保护下加热到2 700℃左右生成的一种碳材料，对基质中色素的去除率可达90%以上，但其表面具有特殊的六元环结构，对含有芳香环、结构具有一定对称性的农药吸附性很强，容易造成目标物的损失。因此，本方法选择PSA与C18进行分散固相萃取净化，两者配合使用，对杂质吸附范围广，能够有效地去除土壤提取液中的极性和非极性杂质，同时在提取液中加入无水硫酸镁，用于除去盐析分配后有机层中的少量水分，以避免PSA粉末吸水性能下降。

 吸附剂的用量对净化效果和农药的回收率影响较大，试验过程中分别用不同质量的PSA( 10、50、100、150和200 mg)和C18(10、50、100、150和200 mg)吸附剂做净化试验，结果发现，在4 mL的提取液中加入150 mg PSA、150 mg C18和300 mg无水硫酸镁能够最大化地净化样品并对回收率影响不大。

 取4.0 mL提取液进行净化，可以富集目标物，提高检出限。乙腈极性较大，直接进样色谱峰容易发生裂分，故采取溶剂置换法，将离心后的乙腈净化液用氮气吹至近干，用丙酮溶解后进样分析。

2.3供试农药的色谱图

 4种供试农药的基质标准溶液色谱图见图2，土壤空白样品及样品加标色谱图见图3、图4。从图中可以看出，供试农药的色谱峰能很好地分离，峰形对称，基线稳定，且标准组分出峰处无明显的干扰杂峰，说明本方法的仪器条件及前处理方法选择合适。色谱图中4种农药的保留时间和浓度分别为：(1)乐果13.099min,0.1 mg/L; (2)毒死蜱15.787 min,0.05 mg/L; (3)杀螟硫磷16.607 min,0.05 mg/L; (4)三唑磷22.684min, 0.1  mg/L。

2.4基质效应

 基质效应是指样品中除待测物以外的其它基质成分对待测物测定值的影响。基质效应针对不同样品和待测物的情况而不同。在气相色谱分析中，大多数农药表现出不同程度的基质增强效应，即相同浓度的农药在基质中的响应值比其在纯溶剂中的高，一般认为是样品中基质成分的存在减少了色谱系统活性位点与待测物分子作用的机会，使得待测物检测信号增强。消除基质效应影响的方法有基质匹配标准溶液法、标准添加法、多重净化法、分析保护剂应用及统计方法校正等。

 本研究中，取空白土壤试样按1.4.1节处理，用其提取液作基质溶液配制标样的响应值(Am)与纯溶剂配制的同等浓度的标样响应值(As)之比表示基质效应，比值越接近1，表明基质效应越小。结果表明，4种供试农药均存在不同程度的基质增强效应，其中乐果的基质效应最强（图5），所以本试验在用外标法定量时，用基质空白提取液为溶剂配制标样，以消除基质干扰，减少误差。

2.5方法的线性范围、回归方程和相关系数

 根据1.4.3节方法，配制质量浓度为0.02~4.0 mg/L的4种有机磷农药基质匹配标准溶液，进行色谱测定，每个浓度平行测定3次，得到乐果、毒死蜱、杀螟硫磷及三唑磷4种农药的线性范围分别为0.04~4.0、0．02~2.0、0.02~2.0、0.04~4.0 mg/L，线性方程分别为y=3 492.6 p-58.195、y=4 339.1 p+309.88、y=5 892.7 p+80.947、y=3 584.1 p+125.22，相关系数(r)分别为

0.999 8、0.999 8、0.998 5和0.998 9，结果表明本方法适用于这4种农药的定量分析。

2.6方法的回收率与检出限

 根据1.4.4节方法，称取5.0 g空白土壤样品，添加适量供试农药标准溶液，使添加水平为0.05~1．O mg/kg，每个浓度水平平行3份样品，按1.4.2节仪器条件测定，基质外标法定量，计算各农药的平均回收率及相对标准偏差（RSD），试验结果见表2。由表2可知，4种农药在土壤中的平均回收率为83.3%—96.6%，RSD为1.3%~9.4%，可见该方法具有良好的准确性和重复性。以最低添加水平色谱图中噪音信号的3倍和10倍计算各农药的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。经汁算，乐果、毒死蜱、杀螟硫磷、三唑磷的LOD值分别为0.013，0.007 7、0.008、0.022 mg/kg，LOQ值分别为0.043、0.026、0.027、0.072 mg/kg。

2.7样品测定

 于苏州市东山某茶园采集土壤样品共16份，利用本方法进行4种农药残留量的检测分析，结果未检出4种农药残留，原因可能是：(1)试验地茶园在茶叶种植过程中没有使用过供试有机磷农药；(2)茶园施用了供试有机磷农药，但由于有机磷农药的自然降解以及迁移，使其残留量低于本方法的检出限，因此检测不到。

3讨论与结论

 本研究建立了气相色谱法测定土壤中乐果、毒死蜱、杀螟硫磷及三唑磷4种有机磷农药的残留分析方法。样品采用冰乙酸一乙腈（V:V=1:99）溶液超声提取，适量PSA和C18分散吸附剂净化，DB -1701石英毛细管柱程序升温分离，GC/FPD检测，基质外标法定量。采用基质匹配标准溶液校准定量，减小了待测农药的基质效应，测定结果更准确。通过试验确证，该方法线性范围宽，检测灵敏度、准确度及精密度等技术指标均满足残留分析的要求，为土壤中有机磷农药残留的分析研究提供了可靠的手段与参考。

 与国家现行标准方法相比，本方法对土壤有机磷农药检测的准确度(83.3%~96.6%)和精密度(1.3%~9.4%)与国标方法的准确度(86.5%~97.6%)和精密度(2.7%~11.3%)相当，但本方法前处理操作简单，提取与净化几步即可完成，而且提取时采用超声波方法，结果稳定，利于批量样品的处理，在大量样品高通量快速检测中优势明显；净化过程避免使用净化柱及大量溶剂洗脱，农药损失少，回收率更高，同时耗费的时间和有机溶剂大大减少，节约检测成本，对环境污染小，对操作者也更安全。分析仪器为实验室常用的配有FPD的气相色谱仪，价格低，操作维护简单，技术要求不如色谱质谱联用严格，适合在普通分析实验室推广使用，具有良好的应用前景。