植物增殖细胞核抗原的结构与功能

李治龙，李晗，李晓屿，李玉花，蓝兴国

东北林业大学生命科学学院发育生物学研究室，黑龙江哈尔滨150040

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[摘要]增殖细胞核抗原( PCNIA)是真核生物细胞中一类保守蛋白，在DNA复制、DNA修复及细胞周期调控过程中具有非常重要的作用。我们简要介绍植物PCNA的结构、表达调控及其功能的研究进展。

[关键词]增殖细胞核抗原；表达调控；DNA复制；DNA修复；细胞周期调控

 增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear anti-gen，PCNA)最初在系统性红斑狼疮患者的血清中首次发现并命名。此后，在酵母和哺乳动物的研究中发现，PCNA在DNA复制、修复和细胞周期调控等过程中发挥着重要作用。近年来，在植物PCNA研究方面取得了一些新的进展。在此，我们简要综述植物中的PCNA结构、表达调控及其功能。

1  PCNA的结构

目前，已在水稻、长春花、大豆、油菜、豌豆、胡萝卜、玉米、拟南芥、烟草和红花菜豆等植物中发现了PCNA（表1）。大豆、水稻、长春花、油菜、豌豆等植物的基因组至少编码1个PCNA，而胡萝卜、玉米、拟南芥、炯草和红花菜豆等的基因组编码至少2个PCNA。

模式植物拟南芥基因组至少编码2个PCNA，它们在氨基酸序列上具有97%的一致性，只有9个氨基酸残基的差异。每一个PCNA蛋白单体由2个相似的亚基组成，每个亚基由一个域间连接环(in-terdomain connecting loop，IDCL)连接每个亚基的C端和N端。拟南芥PCNA双分子荧光互补和生化实验表明，2种PCNA蛋白单体PCNA1和PCNA2可以结合形成4种同源、异源三聚体环状结构，分别为亚基1/1/1、1/1/2、1/2/2和2/2/21。对PCNA三聚体晶体结构的分析表明，PCNA由3个亚基头尾相连构成一个三聚体环，呈伪六重轴对称结构，PCNA环的外层是B折叠，内层富含Q螺旋（图1）。此外，对酵母、人、古细菌、寄生原虫、黑腹果蝇和虾的PCNA晶体结构的研究发现，这些物种的PCNA都构成三聚体环状结构，表明PCNA结构在各物种间高度保守。

2 PCNA的表达调控

 PCNA在植物各组织中都有所表达，而且在细胞增殖旺盛的组织中的表达水平高于成熟组织及非分化细胞，如玉米的根尖、芽、小穗和穗轴，水稻的根和根尖，以及萌发初期的红花菜豆中，PCNA表达水平非常高；而在玉米成熟的叶、穗、花粉，水稻成熟叶，萌发前和萌发后期的红花菜豆中，PCNA表达水平相对较低。

 对水稻PCNA启动子区的分析发现，其启动子上有2个蛋白结合位点11a和11b，这2个位点通过特异结合PCF1和PCF2蛋白，调节PCNA组织特异性的表达。PCNA的表达也受到E2F的调节，在对烟草PCNA启动子的研究中发现，E2F通过与PCNA启动子区2个不同的结合位点作用，调控PCNA在成熟组织和幼嫩组织中的表达差异。Noir等研究发

现PCNA启动子包含顺式调节元件siteⅡmotif和telobox，表明PCNA的表达受细胞周期的影响。除了转录因子调控外，在拟南芥种子萌发过程中，脱落酸通过抑制PCNA1基因的表达水平，从而抑制拟南芥种子的萌发。

 在酵母和哺乳动物PCNA的研究中发现，通过对PCNA泛素化和SUMO化的修饰，可以调节PCNA蛋白的功能。PCNA单泛素化(monoubiquitinat-ed PCNA)可以促进跨损伤DNA合成(translesionDNA synthesis,TLS)过程中DNA聚合酶的募集，从而促进损伤旁路修复；PCNA多泛素化(polyubiqui-tinated PCNA)可能参与并促进以未受损姐妹单体为模板的损伤回避通路。在植物研究中，拟南芥PCNAl/2两种亚型在植物细胞和大肠杆菌中的表达都存在SUMO化901；而且也发现，拟南芥PCNA在UBC和RAD5a的作用下可以被泛素化修饰。但目前对植物PCNA SUMO化和泛素化修饰的生物学功能尚不清楚。

3  PCNA的功能

3.1  PCNA参与DNA复制

 真核生物DNA复制为半保留复制，在多种DNA聚合酶作用下，分别合成前导链和后随链。DNA复制启动后，多种复制相关蛋白结合于复制起始位点，随后由DNA解旋酶将双链DNA解旋成单链，起始合成RNA引物并延伸。人体外同位素标记实验表明，PCNA在复制过程中发挥重要作用：PCNA结合在初始合成的DNA上，当合成到达复制叉处，卸载pola，并且阻止pola再次结合；与pola结合，引导前导链持续合成；与pola结合，合成冈崎片段。在酵母PCNA后随链的合成中，PCNA结合Fenl与Ligl蛋白122.34。植物中也发现并验证了PCNA和Fenl的互作，并且PCNA结合可以增强Fenl活性。目前认为，在DNA复制过程中，PCNA主要是对复制相关蛋白的稳定、招募和动态交换过程起着非常重要的作用。

 跨损伤DNA合成过程是真核生物通过特定合成酶类，如pol 1、pol L、pol K、pol∈、Revl，Rev7，以受损伤或错误DNA为模板复制DNA链。在这一过程中，PCNA可以与多种TLS特异的聚合酶结合，也可以特异结合P21等蛋白，对聚合酶的作用进行调控。通过酶活性测定及酶联免疫印迹等实验分析，哺乳动物PCNA单泛素化形成的Ubp-PCNA通过刺激复制和TLS的酶类来刺激TLS。当PCNA三聚体的稳定性下降时，会影响PCNA与聚合酶类的结合效应，影响TLS。PCNA作为TLS的调节因子募集特殊的聚合酶如pol 11，调节聚合酶与pol 8和pols之间的相互作用，增强损伤旁路活性。在拟南芥2个PCNA亚型相关研究中发现，因PCNAI和PCNA2的亚基在氨基酸Asn201上存在差异，导致TLS相关的pol n只能与PCNA2结合，不与PCNA1结合。

3.2  PCNA参与DNA修复

 植物细胞DNA分子不断受到物理和化学等因素的影响，导致DNA分子出现断裂、碱基的化学修饰或错配。如果不进行正确修复，植物细胞的生长发育会受到严重影响。目前，切除修复( exclsion  re-pair,ER)和错配修复(mismatch repair，MMR)是2条主要途径。在酵母、人和植物研究中发现，PCNA涉及到上述2种DNA修复的功能。

 DNA切除修复途径包括碱基切除途径(base-excision repair，BER)和核苷酸切除途径(nucleo-ticle-excision repalr，NER)。单个碱基错误时以BER方式进行修复，而DNA损伤较严重时以NER方式进行修复。BER过程中，首先需要由DNA糖基化酶形成一个无嘧啶碱基位点（apyrimidinic site，AP位点），由AP核酸内切酶切除磷酸骨架，随后由PCNA介导的DNA聚合酶8/8修复通路修复切口。PCNA在BER中与AP内切酶APnl和APn2、尿嘧啶DNA糖基酶1、3-甲基腺嘌呤DNA糖基酶等结合并发挥作用，在BER修复中参与剪切与再合成这2个关键步骤。NER过程分为全基因组修复和转录偶联的修复，二者的识别机制有所不同。识别损伤后对错误位点进行切除，并通过PCNA结合pol 8/8、RFC、DNA ligl、Fenl等对缺口进行修复合成。切除修复机制的研究主要集中在酵母和哺乳动物中，但近年来大部分相关酶类在植物体中也被发现并得到验证，如胡萝卜中参与BER的尿嘧啶DNA糖基化酶，拟南芥中得到的参与BER的3-甲基糖基化酶、参与NER的多种相关蛋白。这些结果表明，PCNA可能在植物体切除修复过程中也发挥重要作用。此外，Gao等对西红柿中一种PCNA同系物DDI2(damagecl DNA bincling protein interact-ing protein 2)进行研究，发现DDI2表达水平将影响紫外线(UV)诱变下的DNA损伤修复和植物对UV胁迫的耐受性，在过表达DDI2基因的植株中，DNA损伤修复速度加快，在沉默DDI2基因的植株中，损伤修复迟缓，表明其在UV诱发的DNA损伤修复中有非常重要的作用。

 复制后的DNA为半甲基化状态，若发生错配，须将未甲基化的链切除，并以甲基化DNA为模板修复合成。这一过程中需要多种MSH( MutS-homolog)复合体参与位点识别，以及多种修复相关的酶类对位点进行修复。PCNA在这一过程中主要参与pol 8／s合成通路，此外还通过与多种相关蛋白互作发挥功能。通过酵母PCNA点突变株系与提纯的人类MSH蛋白互作分析证实，PCNA可以与MSH3、MSH6蛋白互作，增强其错配位点结合能力。通过放射性标记和多聚核苷酸激酶标记证实，PCNA可以与MSH2-MSH6结合形成三元复合体，促进其与发生错配的未甲基化DNA链的结合，并在ATP作用下转移到错配碱基位点。对植物中MMR的相关研究较少，但在拟南芥中得到了MMR修复必要的MSH2、MSH3、MSH6、MSH7等基因l51.551，表明拟南芥MMR过程与哺乳动物和酵母的MMR过程是相似的，PCNA可能在植物的该过程中发挥作用。

3.3  PCNA参与细胞周期

 细胞周期是细胞在周期时相的不断变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。在人的相关研究中发现PCNA是一种细胞周期相关蛋白，其含量在细胞周期的不同时期差异明显。PCNA通过与几种真核细胞周期蛋白互作，如细胞周期素-CDK复合体、CDK抑制物P21等，参与细胞周期调控。动物细胞中PCNA作为CDK2与其基质的连接物，促进CDK2对RFC、DNA ligl等复制相关酶类的磷酸化。PCNA结合于CDK2-细胞周期蛋白A复合体，催化pol a／引发酶复合体的磷酸化。P21作为一类细胞周期抑制因子，在衰老或基因组损伤的细胞中，P21的N端结合于CDK，C端结合于PCNA，使其无法与RFC.pol 8等结合，通过抑制相关酶类的活性来抑制细胞周期。对植物P21同源基因的研究较少，但植物PCNA可以与人的P21蛋白相结合，表明PCNA在细胞周期相关功能中存在保守性。此外，在拟南芥研究中已经证实，PCNA1和PCNA2能够与细胞周期蛋白D相互作用，表明PCNA在植物体细胞周期相关调控中发挥着重要作用。

4结语

 目前，虽然已获得了几种植物PCNA基因，并对其生物学功能做了一些研究，但许多问题还没有得到阐明。如PCNA在植物组织或器官的表达时空性；拟南芥PCNA的SUMO化和泛素化已经得到证实，但生物学功能是什么，是否还存在磷酸化、甲基化等其他修饰方式；在植物中获得的PCNA互作蛋白信息远远不及酵母和哺乳动物细胞，是否植物中还存在新的相互作用蛋白等等。相信随着植物基因组学及功能蛋白质组学研究的深入，可以进一步揭示植物PCNA的性质及生物学功能。