STAT3对PTEN缺失的HGC27细胞增殖的影响

田秉昌，卫勃，乔振宇，吕晓业，黄芳，王芃，李山虎，周建光，王健，刘文忠

1．内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古呼和浩特010059;

2．军事医学科学院生物工程研究所，北京100850;

3．解放军总医院普外科，北京100853;

4．贵阳医学院附属医院，贵州贵阳550001

——[摘要]目的：初步探索STA'113与HGC27胃癌细胞增殖的关系。方法：用T DNA连接酶将外源片段与酶切后的pLKO.l载体连接，将构建的重组质粒转染293T细胞，48 h后收集上清用于感染HGC27细胞，Wescern印迹检测蛋白的表达，生长实验检测其对肿瘤细胞增殖的影响。结果：基因测序和双酶切鉴定表明敲低STAT3质粒构建成功；慢病毒质粒有效抑制HGC27细胞中STA'r3蛋白水平，抑制STAT3对HCC27细胞的增殖有明显抑制作用。结论：在PTEN缺失的HGC27胃癌细胞中s'rAT3促进肿瘤增殖，但STAT3并不是在所有PTEN缺失的肿瘤细胞中都发挥抑制肿瘤形成的作用。

[关键词] TAT3；P'rEN；胃癌；HGC27细胞

 胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，目前病死率居各类肿瘤的第二位。大多数胃癌确诊病人都是晚期或发生了恶性转移，病人手术后往往会因复发导致死亡，5年存活率不到30%。近年来胃癌的分子靶向性治疗日益受到研究者的关注。信号转导与转录活化蛋白( STAT)是一类由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的转录因子，包括7个家族成员，即STATl、2、3、4、Sa、5b和61 21。其中，STAT3与肿瘤的发生和发展密切相关，一系列体内外实验研究表明组成型活性的STAT3激酶参与肿瘤的发生及恶性进展，因此通常STAT3被认为是一种癌基因。但在最近研究中也发现STAT3具有抑制肿瘤的作用，比如在遗传背景为PTEN表达缺失的神经胶质瘤细胞中，STAT3就具有抑制肿瘤增殖和侵袭的能力。HGC27是一株未分化的PTEN表达缺失的胃癌细胞系，本研究旨在探讨在这种遗传背景下STAT3对HGC27胃癌细胞是发挥促进还是抑制肿瘤增殖的作用，从而为胃癌的临床靶向性治疗提供一定的研究基础。

1材料与方法

1.1材料

 293T、HGC27细胞和pLKO.l载体为本实验室保存；DMEM、胰酶购自GIBCO公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶为TaKaRa公司产品；PCR回收试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自威格拉斯生物技术公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；7-tu-bulin、STAT3、pSTAT3( Tyr705)抗体购白圣克鲁斯生物技术公司；转染试剂购自威格拉斯生物技术（北京）有限公司；CCK8细胞计数试剂盒购于东仁化学科技有限公司。

1.2细胞培养

 293T、HGC27细胞用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM培养基，在5%的CO2孵箱中培养。

1.3抑制STAT3表达的慢病毒表达载体的构建与鉴定

 根据STAT3基因序列设计干扰STAT3表达的shRNA上、下游引物shSTAT3-F（5，-CCGGCGGCGTCCAGTTCACTACTAACTGCAGTTAGTAGTGAACTGGACGCCCJTTTTTG-3 7）和shSTAT3-R(5,- AATTCAAAAACGGCGTCCAGTTCACTACTAACTGCAGTTAGTAGTGAACTGGACGCCG- 3，)，退火；用Age I和EcoR I双酶切pLKO.l载体(37。C，2 h)并回收线性化载体；将退火后的STAT3 RNAi序列连接入pLKO.I载体中，转化大肠杆菌DH5a.，挑选克隆，振荡培养后提取质粒，用P.st I和BamH I双酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆送天一辉远生物公司测序。

1.4慢病毒载体的包装

 将293T细胞接种到10 cm细胞培养皿中，接种量70%—80%，转染前2h换成含新生胎牛血清的DMEM培养液。按照转染试剂说明书将重组质粒和Vigofect转染试剂分别用DMEM按比例稀释，5 min后混合静置30 min后滴入293T细胞，用同样的方法转染对照质粒，12 h后更换含新生胎牛血清的DMEM培养液，48 h后收取上清，用滤器过滤后将病毒液分装，-80。C保存。

1.5病毒感染HGC27细胞

 感染前一天将HGC27细胞接种到60 mm细胞培养皿中，密度为70%—80%，感染时将5 mL病毒上清、培养液和聚凝胺( polybrene)混匀滴入HGC27细胞，12 h后换液，48 h用嘌呤霉素进行筛选。

1.6Western印迹

 将蛋白样品加入5xSDS加样缓存液，煮沸10min后行SDS-PAGE，之后湿转至醋酸纤维膜上，用5%脱脂奶粉在摇床上封闭30 min，加入稀释的一抗，4℃摇床过夜，用TBST洗膜液洗3次，每次5min，加入稀释的二抗，室温6 h，之后用TBST洗膜3次，每次5 min，在暗室中用化学发光液显影、定影。

1.7 CCK8细胞增殖实验

 将敲低STAT3表达的HGC27和对照细胞接种至96孔板中，每孔1000个细胞，在不同时间点加10uL CCK8试剂，37C放置2h后测量D45(h。，值，以时间为横坐标、D450mn值为纵坐标绘制生长曲线。

2结果

2.1  敲低STAT3基因慢病毒载体的构建、鉴定

设计STAT3干扰引物序列时，在铰链区引入了一个PstI酶切位点，载体pLKO.l上没有该位点。用Psi I和BamH I双酶切质粒后如能获得2条长度分别约为6300和600 bp的条带，则表明敲低STAT3基因表达的干扰序列已插入载体。酶切鉴定表明得到了阳性克隆（图1），DNA测序结果显示慢病毒载体构建成功。

2.2  Western印迹检测慢病毒感染后HCJC27细胞中STAT3蛋白水平

用敲低STAT3的慢病毒颗粒感染HGC27细胞，经嘌呤霉素筛选后得到稳定感染慢病毒载体的细胞系。Western印迹检测发现STAT3蛋白表达水平显著降低，说明srrAT3慢病毒载体有效干扰了细胞中STAT3蛋白的表达（图2）。

2.3  生长曲线检测抑制STAT3表达对HGC27细胞增殖的影响

为了探讨HGC27细胞中STAT3活性对其增殖是正调控还是负调控，用CCK8试剂盒检测敲低STAT3表达后对HGC27细胞生长的影响，发现敲低STAT3表达的HCJC27细胞生长明显慢于对照细胞，说明在PTEN缺失的HGC27细胞中STAT3蛋白发挥促进肿瘤细胞生长的作用（图3）。

3讨论

 在肿瘤的发病机制、预防和治疗手段中，信号传导途经的研究越来越受到人们的重视。其中JAK-STAT通路与肿瘤的发生和发展息息相关，其家族中的STAT3与JAK/STAT、P13K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MAPK等通路有关，处于这些信号通路的交汇点。STAT3是重要的核转录因子，同时也是EGF、11-6／JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道汇聚的焦点。研究发现STAT3信号通路的异常激活对肿瘤细胞的增殖、血管发生、侵袭和转移发挥重要的作用。当抑制STAT3表达后，加快了肿瘤细胞的凋亡和减少了肿瘤血管的形成。乳腺癌细胞中自分泌的STAT3对细胞增殖发挥重要作用，同时也有研究发现STAT3和结肠癌细胞的增殖、侵袭、血管发生和转移有关，这一调节主要是通过Bcl-2、p21wafl/cipl，p27kipl、E-cadherin、VEGF和MMP的表达。虽然现阶段研究主要集中在不同遗传背景下STAT3活性的增高促进肿瘤的形成，但也有研究发现在PTEN缺失的神经胶质瘤细胞中STAT3发挥了抑制肿瘤生长的作用，并且这一作用可能与信号通路的补偿有关。但我们在PTEN缺失的HGC27细胞中发现STAT3分子还是促肿瘤的。我们用干扰STAT3表达的慢病毒颗粒感染HGC27细胞后进行Western印迹检测，同时做了细胞生长实验，发现敲低STAT3后HGC27细胞生长明显变慢，说明STAT3在PTEN缺失的胃癌细胞中依然是癌基因。这也提示我们在相同的遗传背景下，不同类型肿瘤细胞中STAT3也发挥不一样的生物学功能。虽然目前尚不清楚STAT3信号通路为什么在PTEN缺失的这一遗传背景下扮演不同的角色，但这一结果可以对胃癌病人分子靶向性治疗及个性化治疗提供一定的研究基础。