埃可病毒25型新型中和实验方法的建立与应用

李姝璇，杨立生，侯汪衡，赵欢，万俊凯，陈梦媛，何水珍，程通，夏宁邵

1．厦门大学生命科学学院，分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室，国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福建厦门361102；2．厦门市疾病预防控制中心，福建厦门361021

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[摘要]目的：建立一种新型的快速、高通量的埃可病毒25型(ECH025)中和抗体检测方法，并初步评价其在ECH025中和抗体筛选和血清流行病学调查中的应用价值。方法：应用免疫荧光方法筛选ECH025高亲和性抗体并将其作为检测单抗，结合酶联免疫斑点检测技术( ELISPOT)建立ECH025中和抗体检测方法；使用不同效价的血清评价该方法的准确性；采用所建立的中和方法对ECH025单克隆抗体、临床血清样品进行检测。结果：建立了快速检测ECH025中和抗体的Nt-ELISPOT方法，以ECH025单克隆抗体589作为检测抗体；相比经典的中和实验方法Nt-CPE，该方法可显著缩短检测时间（从5～7 d缩短至1 d以内），检测结果具有较好的一致性；采用所建立的Nt-ELISPOT方法首次筛选获得3株对ECH025具有较好中和能力的单克隆抗体；临床血清样品检测结果显示厦门地区可能存在ECH025的流行。结论：该方法可以应用于中和抗体筛选和血清学的临床辅助诊断，为ECH025的防治研究提供支持。

[关键词]埃可病毒25型；中和实验；酶联免疫斑点法；中和抗体

 人肠道病毒是常见的病原体之一，一般表现为隐性感染，但部分患者会出现无菌性脑膜炎、肺水肿、心肌炎等临床症状甚至死亡，其中，无菌性脑膜炎是肠道病毒感染重症患者最常见的并发症。有研究报道，在有效控制乙型脑炎病毒后，肠道病毒，尤其是埃可病毒，在中国已成为引起病毒性脑膜炎的主要病原体，对我国婴幼儿的健康造成了严重威胁。埃可病毒25型(echovirus 25，ECH025)隶属于小RNA病毒科（Picorn,aviridae）、肠道病毒属（En一teroviru.s），是人肠道病毒中引起病毒性脑膜炎的常见病原体之一，此外还可引起斑丘疹、急性迟缓性麻痹和肝衰竭等多种疾病。国内外均发生过由ECH025感染引起的散发病例、局部暴发或规模流行。目前，对于ECH025尚无有效的预防或治疗方法，相关研究方法也较为缺乏。

 中和抗体检测对于疫苗免疫原性评价和血清流行病学研究具有重要意义。日前，包括ECH025在内的肠道病毒中和抗体检测主要采用经典的依赖于细胞病变效应(cytopathogenic effect assay，CPE)的中和方法(neutralization test based on CPE，Nt-CPE)，检测周期长、操作繁琐，不利于开展大规模的血清流行病学研究。酶联免疫斑点检测技术( en-zyme linked immunospot assay，ELISPOT)具有检测准确、快速、高通量的优势，已被用于包括多种肠道病毒在内的中和抗体的检测，如肠道病毒71型(EV71 )、柯萨奇病毒A组16型(CAI6)和B组3型(CB3 )、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、登格病毒、轮状病毒等，而ECH025尚未见同类报道。我们以ELISPOT为基础，探索建立一种新型的快速高效的ECH025中和实验方法，以期为ECH025的血清流行病学和相关防治方法研究提供支持。

1  材料与方法

1.1材料

 人横纹肌瘤( thabdomyoma，RD)细胞购白美国模式菌种收集中心(ATCC)，培养于含10% FBS( Gihco)的MFM培养基中；ECH025毒株XM2013-0297( GenBank  No.  KP099941)分离自2013年厦门地区手足口病患者咽拭子临床标本；手足口病疑似患者血清样品由厦门市疾病预防控制中心提供。

1.2抗体制备

 以热灭活的ECH025( l.2xl08  TCID，。/mL)作为免疫原与弗氏佐剂（Sigma）等体积混合，采用皮下多点注射方式免疫6—8周龄SPF级BALB/c雌鼠（上海斯莱克实验动物有限公司），分别于第2、4、6周进行加强免疫。初次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫时采用不完全弗氏佐剂，末次免疫为直接向脾脏注射病毒。应用杂交瘤技术，以PEG4000( Sigma)为融合剂，将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5:1的比例融合，在含HAT( Sigma)的1640选择培养基中培养。以灭活ECH025( 2.5x l05  TCIDso/mL)作为包被抗原，辣根过氧化物酶( HRP)标记的羊抗鼠抗体（1gG，Sigma）为二抗，应用间接酶联免疫吸附法( ELISA)检测融合细胞培养卜清，通过有限稀释法对阳性克隆孔进行克隆。将单克隆抗体细胞打入小鼠腹腔诱导腹水，用硫酸铵盐析法和Protein A亲和层析法纯化小鼠腹水。采用经典过碘酸钠( Nal0。)法对单克隆抗体进行HRP标记1221，保存于-20C。

1.3免疫荧光检测(lFA)

 将RD细胞加入预先铺有玻片的24孔细胞培养板中，感染10 uL肠道病毒；14 h后，每孔加入100uL 4%多聚甲醛，室温避光30 min;用0.3% TrionX-100通透细胞10 min，山羊血清封闭th；以本实验室制备的ECH025单克隆抗体为一抗，37。C孵育1 h；以异硫氰酸荧光素( FITC)标记的羊抗鼠抗体(IgG，Sigma)为二抗，37C反应30 min;加入DAPI(Invitrogen)核染5 min后．荧光显微镜(TE2000，Nikon)下观察并拍照。

1.4  Nt-ELISPOT应用于中和抗体检测

 将待测样品（血清样品须56C灭活30 min）加入96孔U形板中，按1/2的梯度从1：8稀释至1：8192，加入等体积的ECH025病毒悬液，37C孵育lh；取100 uL混合物加至预铺有RD细胞(20 0001孔)的96孔细胞培养板中，370C、5% CO2培养。14 h后如下进行酶联免疫斑点实验：每孔加入IOO uL0.2%的戊二醛同定液，室温避光1 h；加入1%的Tri-ton X-100通透液，室温静置30 min；加入HRP标记的ECH025特异性单克隆抗体589，37。C孵育30min；用PBST(PBS+0.5% Tween 20)漂洗5次，加入TMB显色液（Sigma），37。C显色10 min;通过酶联斑点分析仪(Cellular Technology Limited，CTL)扫描和蓝色斑点数统计，按下式计算感染抑制率(P):

其中，N。，代表实验孔的斑点数，N。11。。，，，和NirLJ.。。。分别代表未感染病毒的RD细胞和感染病毒的RD细胞的每孔平均斑点数。样品的中和效价定义为：P值≥50%时的最高稀释率。

1.5 Nt-ELISPOT应用于中和性单克隆抗体筛选

 取50 uL本实验室前期制备的ECH025单克隆抗体(1 mg/mL)加入96:fL U形板中，按1/2的梯度从1：8稀释至1：8192，与等体积的ECH025( 1.5×10'TCID，。／孔)混合，37℃孵育1 h；取100 uL混合物加至预铺有RD细胞（20 0001孔）的96孔细胞培养板中，置37。C、5% CO2培养箱中，培养14 h后按卜-述方法进行酶联免疫斑点实验并计算样品的中和效价。将中和效价≥16的样品判定为ECH025中和性单克隆抗体。

2  结果

2.1  ECH025 Nt-ELISPOT方法的建立

应用免疫荧光法，我们从前期获得的ECH025单抗中筛选获得一株单克隆抗体589（IgGl亚型），该单抗对感染ECH025后的RD细胞具有较好的反应活性，对未感染病毒的RD细胞无明显反应(图1A)。我们对单克隆抗体589进行HRP标记，应用ELISPOT方法分别对ECH025、EV71和CA16等肠道病毒感染后的RD细胞进行检测，结果显示HRP标记的589在1：10000稀释度下可以特异识别被ECH025感染的RD细胞，在加入显色底物TMB后，被感染的细胞显示为蓝色斑点；而不能识别被EV71、CA16、CB3和ECH030感染的RD细胞(图1B)，具有良好的检测特异性。我们进一步探索了不同的病毒感染剂量对ELISPOT检测实验的影响，将ECH025(1.2x107 TCID，．，/mL)以1/2梯度进行系列稀释并分别感染RD细胞，感染14 h后用HRP标记的589进行ELISPOT检测。结果如图1C所示，检测斑点数与病毒感染剂量呈正相关，当病毒感染剂量为1.9x104—1.5xi05 TCID；．，／孔时，检测斑点数与病毒感染剂量的对数值具有较好的线性关系( R2=0.9924)。通过分析，本研究选择以HRP标记的单克隆抗体589（1:10 000稀释）为检测抗体，病毒感染剂量为1.5x10s TCIDs。1／孔，感染时间为14 h，以上述条件建立ECH025中和抗体检测方法Nt-ELISPOT。

2.2  Nt-ELISPOT方法与经典Nt-CPE方法的一致性分析

依赖于细胞病变效应的Nt-CPE方法是检测肠道病毒中和抗体的“金标准”方法。为评价本研究建立的ECH025 Nt-ELISPOT方法与经典Nt-CPE方法的一致性，首先用经典Nt-CPE方法筛选获得4份血清，分别为ECH025抗体阳性人血清（中和效价为1：1024）、ECH025免疫小鼠血清(中和效价为1：4096)、ECH025抗体阴性人血清（中和效价<1: 16）和ECH025抗体阴性小鼠血清（中和效价<1: 16）。将上述4种血清样品分别以1/2梯度稀释，应用本研究建立的Nt-ELISPOT方法分别检测稀释后的血清样品的ECH025中和抗体效价。结果显示，2份ECH025抗体阳性血清样品（图2A、B）的中和效价均随血清稀释率的增加按1/2梯度下降，与预期效价具有良好的一致性，而ECH025抗体阴性血清样品的中和效价均<1:  16（图2C、D）。-卜述结果说明，本研究建立的Nt-ELISPOT方法与经典Nt-CPE方法的检测结果具有较好的一致性。

2.3  Nt-ELISPOT方法应用于抗ECH025中和单抗的筛选

进一步应用建立的Nt-ELISPOT方法检测前期获得的ECH025单克隆抗体的ECH025中和效价，筛选获得3株ECH025中和单抗，分别为2E9(IgG2a)、4G2 (IgG2a)和14H7 (IgM) -Nt- ELISPOT检测结果显示，3株单抗均可阻断ECH025对RD细胞的感染（图3A），其中和效价分别为1：8192、1：2048和1：256（图3B）。免疫荧光检测结果显示，上述3株中和单抗与ECH025感染后的RD细胞具有良好的反应性（图3C）。

2.4  临床样本检测

 随机选取厦门地区80份2014年手足口病疑似患者血清标本（男性患者51例，女性患者29例，平均年龄2.3岁），用本研究建立的ECH025 Nt-ELISPOT方法对其进行检测，以1:16为中和抗体阳性判定标准。结果显示，80份血清样品中有43份为ECH025中和抗体阳性，阳性率为53.75%（图4），提示ECH025在厦门地区人群中可能存在流行感染。

3讨论

 肠道病毒的流行病学调查主要依赖于采用RT-PCR方法检测样品中病毒核酸含量，但该方法受限于病毒在宿主体内存活时间的影响。相比而言，血清抗体水平检测可反应病毒的当前或既往感染情况。同时，中和抗体被认为是评价疫苗免疫原性的关键指标。因此，对于病毒流行病学调查或防治方法研究，中和抗体检测方法的准确性与高效性均具有重要意义。

 Nt-CPE方法是经典的肠道病毒中和抗体检测方法，但存在一些不足，如实验周期长，通常需要5~7 d；操作过程繁琐，不适于大量标本的检测；依靠肉眼观察，结果存在一定的主观误差。因此，肠道病毒新型中和实验方法不断出现。Huang等依据ELISA法建立了检测EV71中和抗体方法，将检测时问缩短至2 d。随后建立的基于假病毒的中和抗体检测方法，相对活病毒而言操作更加安全。我们以ELISPOT方法为基础，探索建立了ECH025的新型中和抗体检测方法。ELISPOT方法已成功应用于肠道病毒EV71、CB3、CA16等中和抗体的检测，该方法仅需一台酶联斑点分析仪和一株能够与待洲样品特异性结合的单克隆抗体，将抗体进行HRP标记后即可捕获被病毒感染的细胞，当加入显色底物TMB时，被感染的细胞被染成蓝色，从而区别于未被病毒感染的细胞。Nt-ELISPOT方法依赖于特异性抗体与病毒蛋白的相互作用，不须等待细胞病变的发生，1d内即可完成检测。此外，96孔板及酶联斑点分析仪的应用便于结果分析与保存，大大提高了检测通量，也避免了经典Nt-CPE方法带来的主观误差。

 目前，ECH025相关研究尚局限于毒株的分离与基因序列的进化分析，研究基础较为薄弱。本研究应用Nt-ELISPOT方法首次筛选获得3株ECH025中和性单克隆抗体，可以为进一步开展ECH025中和表位和相关疫苗研究提供条件。同时，通过对随机选取的厦门地区的80份手足口病疑似患者血清进行中和抗体检测，发现53.75%的血清样品显示ECH025抗体阳性，表明ECH025在厦门地区可能存在流行感染，有待开展更深入和全面的研究。已有研究显示，多种肠道病毒之间存在共感染和共流行现象。在我们通过检测获得的ECH025抗体阳性的人血清样品中，部分样品经RT-PCR检测显示含有EV71、CA6等不同型别肠道病毒核酸，表明厦门地区可能存在ECH025与EV71、CA6或其他肠道病毒共感染情况，提示我们应当进一步提高肠道病毒诊断技术，加强对多种肠道病毒流行情况的全面监测。

 综上所述，本研究建立的人肠道病毒ECH025新型中和实验方法具有特异性强、耗时短和通量高等优点，为快速、高效开展ECH025血清流行病学调查及相关防治方法研究提供了支持，同时也可为其他病毒中和抗体检测方法的建立提供参考。