人乳头瘤病毒6/11型L2片段的高效表达及免疫效果评价

任皎，张忠献，赵莉，郝明强，田厚文，谭文杰，阮力

1．中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京102206;

2．郑州大学中英分子肿瘤学研究中心，河南郑州450052

 [摘要]目的：原核表达人乳头瘤病毒( HPV)6型和11型L2 N端融合蛋白，并初步评价其免疫效果。方法：用重叠PCR将HPV6和HPVI1次要衣壳蛋白L2基因5 ’端片段融合，并在大肠杆菌中表达融合蛋白，纯化后与Al(OH)，佐剂配伍肌肉注射免疫BALB/c小鼠，用ELISA检测血清抗体，以基于假病毒的体外中和试验评价中和抗体水平。结果：ELISA结果显示，3种融合蛋白均能产生针对同型别L2蛋白的高滴度特异性IgC抗体，滴度为1:10 000～1:200 000;体外中和试验显示，3种融合蛋白均能诱发中和抗体和交叉中和抗体，针对同型别的滴度最高可达1：3200，对于高危型能产生一定水平的交叉中和抗体，滴度为1:50～1: 800。结论：HPV6/11 L2融合蛋白能够诱发较强的体液免疫反应，产生较高的中和抗体及交叉中和抗体，为HPV L2新型预防性疫苗的研究提供了初步的实验基础。

[关键词]  人乳头瘤病毒；融合蛋白；预防性疫苗，中和抗体，次要衣壳蛋白L2

 人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一组嗜上皮组织的小双链DNA病毒，具有严格的种属特异性和组织特异性，仅感染人的皮肤和黏膜上皮，并且不同型别的HPV对机体不同部位的皮肤和黏膜的嗜向性不同。HPV主要引起皮肤、黏膜的良、恶性肿瘤，目前已发现100多型，其中30多种型别与口腔、生殖道黏膜肿瘤形成有关。根据这些HPV致瘤性的不同又可分为2组：低危型，主要包括HPV6、11，导致以尖锐湿疣为主的良性生殖疣以及复发性呼吸道乳头瘤病(recurrent respiratory papil-lomas，RRP)等良性病变；高危型，主要以HPV16、18型为主，与宫颈癌的发生关系最为密切，其次为45、31、33、52、58型等。因此，HPV疫苗研究意义重大。

 早在上世纪90年代初HPV疫苗研究就已展开，2006年成功上市。其中默沙东( Merk)公司的HPV预防性疫苗Gardasil，是由HPV6、11、16和18型的L1病毒样颗粒(VLP)组成的四价疫苗；葛兰素史克( GSK)公司的HPV预防性疫苗Cervarixl31，是由HPV16、18型的Ll VLP组成的双价疫苗。上述疫苗对同型别HPV的保护率为100%，可以预防70%宫颈癌的发生。而2014底默沙东公司的Gardasil 9（9价HPV Ll VLP疫苗）上市，能预防90%的宫颈癌发生。尽管如此，这种Ll形成的VLP疫苗制备成本高，难以在全球广泛推广；且具有型别特异性缺乏交叉保护作用，不能预防其他型别的HPV感染。因此，要在全球范围内特别是贫穷落后地区预防宫颈癌的发生，还需要研发安全、有广谱效果，且价格低廉的新型疫苗。

 HPV次要衣壳蛋白L2具有广谱中和表位，同时L2类疫苗为线性表位，可在原核系统中表达生产，工艺简单，造价低廉。与基于L1蛋白的VLP疫苗相比，虽然L2蛋白诱发的特异性抗体滴度较低，但佐剂的使用目前已使L2疫苗的研究取得了一些新进展。已有诸多研究表明，其N端蛋白片段可诱发动物产生具有交叉中和活性的抗体，并能保护动物免受其他型别病毒的攻击。因此，HPV L2具备作为第二代新型HPV预防性疫苗的研发潜力。

 我们根据我国流行病学资料选择主要HPV流行型别，在前期本课题组已构建并筛选出能诱导高滴度中和抗体的高危型HPV18/16/58型（三价）L2融合蛋白疫苗的基础上，本研究选择低危型HPV6和HPV11型，将其编码L2 N端具有交叉中和活性区域的基因融合，在原核表达系统中表达纯化融合蛋白，评价筛选能诱发中和抗体和交叉中和抗体的融合蛋白，为五价融合蛋白疫苗的构建奠定基础。

1  材料与方法

1.1材料

 6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自中国医学科学院医学实验动物研究所；293FT细胞购自Invitrogen公司；大肠杆菌DH5a、BL21( DE3+)感受态细胞由本课题组制备；HPV6、45型假病毒为中国食品药品检定研究院吴雪伶赠送；pMD18-T载体(TaKaRa#D103A)、pET- 9a载体、携带HPV6b全长基因的pBR322-HPV6b克隆质粒、携带HPV11 L2 E7基因的pUC-HPV11L2E7克隆质粒均为本实验室保存；用于HPV假病毒包装的含密码子优化4种不同型别HPV结构蛋白L1、L2基因的表达质粒(pllLlw，p11L2w，she1116，she1118，she1152，she1158)、携带绿色荧光蛋白报告基因的质粒pfwb为美国国家癌症研究所John T．Schiller教授惠赠；PCR引物合成自上海生T公司；Pfu、Taq酶购白北京天根公司；限制性内切酶、T。DNA连接酶购白NEB公司；IPTG购白北京欣经科公司；Western印迹一抗（HPV6b L2鼠多抗）由本课题组制备；HRP标记羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥公司；His-Bind纯化介质购自Amersham公司；ELISA包被抗原各型别L2蛋白由本课题组制备；其他化学试剂为国产分析纯。

1.2构建L2融合片段及其表达质粒

各型别L2基因片段通过PCR获得，型别间片段的融合采用重叠PCR方法，其中HPV L2融合基因的5 7端含Nde I酶切位点，3 7端含BglⅡ酶切位点，且各融合片段5 7端均带有6个组氨酸标签以便纯化。重叠PCR扩增获得的HPV6、HPV11 L2 5 7端不同大小的融合基因片段见表1，通过NdeI和BglⅡ酶切位点插入原核表达载体pET-9a。

1.3融合蛋白表达、鉴定与纯化

 将含目的基因的pET-9a表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3+)菌株，挑单克隆接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃、250 r/min振荡培养过夜；将菌液按1：100的比例转接到新鲜LB中，370C、250 r／min振荡培养3 h，至D600。，，值为0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol/L,于37qC诱导表达2.5 h；收集菌体重悬于裂解液中，经冰浴超声波破碎后，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析融合蛋白的表达形式，Western印迹（一抗浓度1：200，二抗浓度1:5000）鉴定融合蛋白，用His-Bind亲和层析纯化融合蛋白。

1．4小鼠免疫接种

 采用随机分组方法将24只6～8周雌性BALB/c小鼠分为4组，即3个融合蛋白组、1个PBS对照组，每组6只。选择Al(OH)，作为佐剂，每组蛋白用量20 p4g/只，Al( OH)，100 Vg/只，均于小鼠左后下肢肌注。初免4周后加强，加强2周后采血评价。

1.5  ELISA检测血清中HPV L2的总抗体水平

 以各自型别的L2蛋白或融和蛋白作为包被抗原，分别为HPV6 L2、HPV11 L2E7、HPV16 L2、HPV18 L2、HPV58 L2蛋白，包被抗原200 ng/孔，4℃包被过夜，PBST洗板后用含5%小牛血清的PBS 37C封闭1h，加入稀释后血清，37C孵育2h，洗板后加入二抗（浓度1:10 000），37。C孵育1 h，洗板后加入底物显色，2～3 min后终止反应，酶标仪读取D450nu，值。

1.6假病毒的制备

 预先铺6xl06／15 mL 293FT细胞于75CIll2细胞培养瓶中，置37℃、50/0 CO：孵箱中培养，待细胞汇合达60%，用LipofectAMINE 2000将结构基因表达质粒( p6LLw、pllLLw、p16LLw、p18LLw、p45LLw、p52LLw、p58LLw)分别与报告质粒pfwb共转染293FT细胞，48 h后收集细胞，加入与细胞沉淀等体积的细胞裂解液（0.5%的Brij58），混匀，37。C孵育24 h，取出细胞裂解液，冰浴5 min后加入0.17倍体积的5 mol/L的NaCl溶液，使盐浓度调整为850mmol/L，冰浴10—20 min，5000 r/min离心20 min，取上清，分装，并于-70℃冻存备用。

1.7体外中和试验

 铺293FT细胞于96孔板(每孔细胞数2.0x 104/100 uL)中，置37qC、5% C02孵育过夜；将各型假病毒分别稀释至200 TCID，。，/50 uL，将待测血清从1：25开始梯度稀释，同时设立阴性血清对照及空白对照；在96孔板上每孔加入80uL病毒稀释液及80VL阳性血清稀释液，混匀，4℃放置1 h；从各孔中吸取100 uL假病毒血清混合物，贴壁缓缓加入预先已铺好细胞的96孔板中，轻拍四周混匀；将细胞继续培养72 h，以感染抑制率大于50%的最高血清稀释度的倒数作为血清的中和滴度。

2结果

2.1  原核表达质粒的构建与鉴定

PCR扩增出HPV6b L2-88、HPV6b L2-200、HPV11 L2-88、HPV11 L2-200各基因片段，然后经重叠PCR扩增获得融合基因片段HPV6/11-88/88，HPV11/6- 200/200、HPV11/6- 200/88（表1），经酶切消化后插入pET质粒相应位点，重组质粒经酶切鉴定后测序，结果表明pET- 6/11- 88/88、pET- 11/6-200/200、pET-ll/6-200/88中目的基因序列与设计序列相符。

2.2  HPV6、HPV11 L2 N端不同大小片段融合蛋白的表达及鉴定

取100 uL菌液到微量离心管中，12 000 r/min离心1 min，弃上清，加入50 uL lxSDS上样缓冲液，混匀，煮沸5 min，取5uL上样于12%的SDS-PAGE胶中，经电泳、考马斯亮蓝染色后观察蛋白表达情况。结果（图1）分别在相对分子质量约isxi03、37xi03和58xl03处出现明显新增蛋白表达条带，除HPV6/11-88-88外，其余2个融合蛋白均比预测分子大，这可能与HPV L2的特殊二级结构有关，也与其他文献报道相似。Western印迹（图2）结果也显示在对应分子大小处出现特异性反应条带，说明目的蛋白在大肠杆菌中获得正确表达。

2.3  HPV6/11 L2 N端各融合蛋白的纯化

由于HPV6/11 L2 N端不同大小片段融合蛋白的C端据均有6个组氨酸标签，因此选用His-bind亲和层析柱纯化目的蛋白。以HPV11/6-200/200蛋白为例阐述目的蛋白的纯化过程：用3个柱床体积缓冲液(50 mmol/IJ Tris-HCl pH8.0,0.5 mol/L NaCl,8 mol/L尿素)洗脱未结合的蛋白，再用50 mmol/L咪唑洗脱缓冲液（50 mmol/L咪唑，50 mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素）洗脱杂质蛋白，最后用150 mmol/L咪唑洗脱缓冲液(150mmol/L咪唑，50 mmol/L Tris-HCI pH8.0,0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素）洗脱目的蛋白。透析除去尿素后经SDS-PAGE分析，纯化的3种目的蛋白分子大小与预期相符（图3）。用Gel-Pro Analyzer 3.1软件分析，3个蛋白的纯度均达到90%以上。

2.4  HPV6/11 L2 N端各融合蛋白的免疫效果评价

2.4.1  HPV6/11 L2 N端各融合蛋白所诱发的总1gG水平小鼠免疫结束2周后，收集分离血清，以正常小鼠血清为阴性对照，分别以HPV6 L2、HPV11 L2、HPV16 L2、HPV18 L2、HPV58 L2蛋白为包被抗原，ELISA检测1gG水平。结果见图4，各融合蛋白组小鼠血清中均检测出针对同型HPV L2蛋白的特异性高滴度1gG抗体，滴度为1:10 000—1:200000，且针对高危型别16、18、58的抗体滴度也在1：1000～1:32000之间。

2.4.2 HPV6/11 L2 N端各融合蛋白所诱发的中和抗体及交叉和中和抗体水平每组BALB/c小鼠免疫后血清6份，各取50 111，混匀后共300 p4L，1:5稀释，用微型过滤器过滤除菌，置-30。C保存。分别利用HPV6、11、16、18、45、52和58型假病毒中和试验检测各组小鼠免疫后血清的中和抗体水平，各血清从1:25开始稀释，抑制率大于50%的最大稀释倍数的倒数作为血清的中和滴度。结果显示，3种融合蛋白均能诱发出中和抗体和交叉中和抗体，针对同型别的滴度高，最高可达1：3200，对于其他基因型也产生一定水平的中和抗体，滴度从1：50到1：800不等。HPV6/11二价融合蛋白200/200针对同型的中和抗体滴度比其他2种融合蛋白高。针对高危型交叉中和抗体中，以52型为高(1: 800)，针对16、1 8型的交叉中和抗体水平较低(1：50)。结果见图5。

3讨论

 理想的疫苗不但要保护范围广，而且要价格低。现已上市的HPV Ll VLP疫苗虽然能有效预防HPV感染及相关疾病的发生，但其成本高、价格昂贵，同时保护具有明显型别限制性的缺点，即使2014底默沙东公司的Gardasi19上市，能预防90%的宫颈癌发生，但仍有10010的宫颈癌得不到预防。L2蛋白作为HPV的次要衣壳蛋白，序列高度保守，能诱导产生交叉中和抗体，且中和抗体表位为线性，可在成本低廉的大肠杆菌系统中表达制备，因此其在二代HPV预防性疫苗研发中具有很好的前景。本研究获得的HPV6/11 L2融合片段免疫小鼠后能诱发强的体液免疫反应，其抗体不但能中和融合蛋白中含有的HPV型别（HPV6/1），而且还能中和未包含在融合蛋白中的型别( HPV16、18、45、52、58)。融合蛋白免疫产生范围广的免疫反应，可能是由于在融合构建时，识别多种HPV型别共有的L2特异性中和抗体表位的B细胞被激活，使免疫反应交互增强，这种增强更倾向于交叉中和抗体的产生。

 我们的结果与之前的发现的HPV L2的中和表位主要集中在N端前200个氨基酸残基( 17～36、20—38、36～49、69～81、108—120等)的结果一致。此前Jagu等研究多型别L2融合蛋白免疫兔子和小鼠的结果也提示，多型别L2融合能诱发比单一型别更高滴度的中和抗体和交叉中和抗体。但不同的融合片段11- 200×3（HPV6、16、18型）、11- 88×5（HPV1、5、6、16、18型），或17-36x22（5种皮肤型别，2种黏膜低危型，以及15致癌基因型）的结果不同，其中ll-88x5诱发中和抗体和交叉中和抗体的能力最强。Rubio等发现细菌硫氧还蛋白展示的串联的HPV16 L2(20-38)能诱导强的免疫反应，能中和HPV18、58、45、31型假病毒，但不同数目的融合片段产生的抗体反应滴度不同。这些提示我们不同片段的组合方式对HPV L2的免疫原性有影Ⅱ向。我们获得的3种融合蛋白的结果也证实各个片段不同的排列组合方式对免疫原性有一定的影响。此外，我们在构建融合基因时，其他几种基因排列融合结构的蛋白没能获得有效表达。

 L1 VLP即便是在无佐剂的情况下也能诱发滴度高、持续时问长的保护性抗体反应，L2融合蛋白诱发产生的中和抗体比前者低，有效的佐剂选择就显得十分重要。本研究中我们只使用了Al(OH)，佐剂；McGarvie等用1mg牛乳头瘤病毒4(BPV4) L2同弗氏不完全佐剂一起免疫2次，免疫1年后还可以保护牛免受BPV4的攻击。Jagu等报道了ll-88x5( HPV1、5、6、16、18)不同佐剂的使用情况，对于融合蛋白中没有的型别体外中和试验中和抗体，Al( OH)，和单磷脂A( MPL)或CpG混合使用比单独使用铝佐剂的效果好，对于融合蛋白中含有的HPV型无差别。早期的研究观察到用ll-200x3免疫4个月后用HPV16假病毒攻击，结果表明铝佐剂和ISS1018共用比单独使用铝佐剂保护程度高。这提示我们选择合适的佐剂能改善HPV L2融合蛋白的免疫反应，并极有可能使HPV L2融合蛋白作为新型疫苗的研究走向一个新阶段。

 后期我们将用构建的HPV6/11二价融合蛋白基因与高危型HPV16/18/58三价融合蛋白基因融合构建五价HPV16/18/58/6/11 L2融合基因。考虑到原核高效表达对基因片段长度有一定的限制，且多型别片段的融合还可能进一步增强免疫效果，所以将首选分子小的低危型HPV6/11-88/88片段与高危型三价HPV18/16/58片段融合并进行表达，评价其免疫效果，为我国HPV二代预防性疫苗的研发提供科学依据。