李瑞花，付汉江，沈远，钟一然，朱捷，郑晓飞
1．军事医学科学院放射与辐射医学研究所，放射生物学北京市重点实验室，北京100850;
2．安徽医科大学研究生学院，安徽合肥230032
[摘要]目的：利用CRISPR/Cas系统在XRCC6基因5’端插入Flag标签序列，筛选XRCC6-Flag稳定表达的宫颈癌细胞( HeLa)株。方法：根据GenBank中XRCC6基因序列，设计XRCC6基因敲入的gRNA序列，构建入pCas-Cuicle载体中，获得pCas-XRCC6载体；设计XRCC6基因的同源臂序列，利用搭桥PCR方法将同源臂和F'lag标签序列作为模板进行扩增，得到供体DNA片段，并将其克隆到pBackZero-T表达载体上，获得pXRCC6-Donor载体；将上述2个载体共转染H。La细胞，采用PCR.W。。t。。n印迹等方法检测和筛选Flag标签序列插入XRCC6基因5 ’端的细胞株。结果：构建了pCas-XRCC6和pXRCC6-Donor载体，筛选获得3株XRCC6-FIag稳定表达细胞株。结论：构建了XRCC6-Flag稳定细胞株，为研究XRCC6基因及其蛋白产物的生物学功能奠定了基础。
[关键词]CRISPR/Cas系统；XRCC6基因；Flag标签
近年来，锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)、转录激活因子效应物核酸酶(transcription ac-tivator-like effect nucleases,TALEN)、规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspacedshort palindromic repeat, CRISPR)及其相关基因(CRISPR-associated genes，Cas)系统等基因编辑技术的发展，为在生物体内和细胞中对基因组进行编辑和基因功能研究提供了简便高效的技术方法。CRISPR/Cas作为一种新型基因编辑工具，可以高效地在内源环境中选择性改变机体基因组DNA的功能，这为生物学和医学等方面的研究提供了条件。
CRISPR/Cas系统最早在古细菌和细菌中发现，是长期进化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，避免病毒或质粒等外源DNA的侵入。根据Cas基因核心元件序列的不同，可将CRISPR/Cas系统分为3种类型，其中Ⅱ型CRISPR/Cas系统被改造后广泛应用于基因组的编辑。利用CRISPR/Cas系统将器官、细胞基因组DNA序列进行删除、插入或修饰，有利于研究基因或调节元件的具体功能。CRISPR/Cas系统由一段特异的长度约20 bp的靶向序列、通用结构支架和Cas9核酸内切酶组成。20bp的靶向序列和通用结构支架形成一个复合体，称作sgRNA(single guide RNA)，sgRNA通过碱基互补配对与基因组靶位点NGG[protospacer adjacent mo-tif( PAM)，前问区序列邻近基序]后紧随的20 bp序列结合，并引导Cas9核酸内切酶在PAM上游第3个碱基处引发DNA双链断裂。双链DNA的断裂会激活细胞内部的DNA损伤修复应答反应，利用非同源末端连接修复机制或同源重组修复机制对断裂位点进行修复。非同源末端连接修复容易造成错配或片段丢失，因此利用非同源末端连接修复机制修复可以进行某基因敲除或DNA片段删除。同源重组修复是精确修复，当带有损伤位点两侧同源序列的模板存在时，会发生同源重组修复，通过在2条同源臂之问加入外源DNA序列，可以在断裂位点插入一段其他的DNA序列，从而在断裂位点插入新的遗传信息。CRISPR/Cas系统利用了简单的碱基互补配对原则，在基因组的PAM前面设计一段适当的长度为20 bp的gRNA，CRISPR/Cas系统能够将该处DNA双链发生特异性断裂。人类基因组大约每810 bp就包含一个PAM，因此CRISPR/Cas系统几乎能靶向人类的任意基因。CRISPR/Cas技术已在工业、农业及基因治疗等方面得到广泛应用，在人类细胞、斑马鱼、小鼠中实现了基因组定点编辑。
XRCC6(X-ray complementing defective repair inchinese hamster cells 6)在DNA损伤修复中具有重要的生物学功能。我们利用以上原理，在XRCC6基因5 ’端插入Flag标签序列，XRCC6基因表达的蛋白（Ku70蛋白）与Flag标签蛋白融合，融合后的XRCC6- Flag蛋白不会改变先前XRCC6蛋白的功能，为研究XRCC6基因及其蛋白产物的生物学功能奠定了基础。
1 材料与方法
1.1材料
HeLa细胞由实验室保存；大肠杆菌DH5a购自天根生化科技北京有限公司；A-Tailing Kit，pBack-Zero-T载体、DNA相对分子质量标准均为TaKaRa公司产品；pCas-Guide载体购自Origen公司；质粒小提试剂盒为Promega公司产品；脂质体转染试剂Li-pofectAMINE 2000购白Invitrogen公司；限制性内切酶BamH I、T4 DNA连接酶均为Fermentas公司产品；ECL化学发光试剂、限制性内切酶BsmB I为Thermo Scientific公司产品；蛋白相对分子质量标准购自北京凯诺春天生物科技有限公司；KOD-Plus-Neo为TOYOBO公司产品；anti—DDDDK-Tag为MBL公司产品；Ku70抗体为Santa Cruz Biotechnology公司产品；3-actin抗体为Proteintech公司产品；辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠lgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；胎牛血清购白康源生物技术有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、细胞基因组DNA提取试剂盒购自北京百灵克生物科技有限公司；anti-Flag M2 Afficity Gel为Sigma公司产品；RIPA裂解液、琼脂糖珠洗涤缓冲液(Tris-HCl 50 ymol/L．pH7.5；NaCI 150ll,mol/L)均为实验室配制；引物(表1)由Invitrogen公司合成。
1.2 构建pCas-XRCC6载体
在Blue Heron网站(http://wwws.f)lueheronbio.Com/external/tools/gRNA Src.j sp．)设计长度为20 bp的gRNA序列，本实验选择了3条gRNA序列（表1）。将3条gRNA序列两端分别添加BamH I和BsmB I酶切位点，94。C退火5 min形成dsDNA，室温放置30 min，用T4DNA连接酶将BamH I和BsnzB I酶切回收后的pCas- Guide载体和退火后的dsDNA片段连接，得到载体pCas-XRCC6Ul、pCas-XRCC6U2和pCas-XRCC6U3，将上述连接产物转化大肠杆菌DH50感受态细胞，涂布于含有氨苄西林(Amp)的LB琼脂糖平板上，37。C孵育过夜，挑菌培养，提取质粒，送天一辉远公司测序。
1.3 构建供体DNA载体
根据GenBank中XRCC6基因序列设计引物，以HeLa细胞基因组为模板，以Flaglf和Flag2r为引物扩增左同源臂片段Al，以Flag3f和FJag4r为引物扩增右同源臂片段A2（PCR条件：94C2 min; 94C15 s．52。C 30 s，68Cl min，行35个循环；680C10 min．25℃2 min)。琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收目的条带。以片段Al、A2共同作为模板，以Flaglf和Flag4r为引物，PCR扩增得到供体DNA片段B，用A-Tailing Kit在DNA片段B的末端加上单个碱基A，并将该片段克隆到pBackZero—T载体上，挑取单克隆，以引物Flaglf和pBackZero-T载体下游鉴定引物BlaRV(5'- ACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCA-3)进行菌落PCR鉴定，提取质粒测序。
1.4细胞转染及稳定株的筛选与鉴定
将上述构建的3个pCas-XRCC6载体（1ug）分别和pXRCC6-Donor载体(1.5 Vg)共转染HeLa细胞（转染试剂LipofectAMINE 2000），转染后第8d（约传代2—3次）收取细胞，在蛋白水平检测3个pCas-XRCC6载体分别和pXRCC6- Donor载体共转染HeLa细胞后，Flag标签序列插入XRCC6基因的效率。将共转染后Flag标签序列插入效率最高的HeLa细胞接种到含有20 mL DMEM（含10%胎牛血清）的细胞培养吼(15 cm)中（lXl03/皿），每隔4d换一次细胞培养液，培养10 d后，挑取单克隆细胞接种于96孔板中继续培养。待细胞传代于6孔板中时，取1/10保种，剩余细胞裂解，Western印迹鉴定Flag标签序列是否插入XRCC6基因并表达。取少量在蛋白水平鉴定成功的XRCC6- Flag稳定表达细胞株，提取基因组DNA，以Flag和Flag4r为引物行PCR扩增，在基因组水平验证Flag标签插入XRCC6基因5 ’端。
1.5 免疫共沉淀
将筛选出的XRCC6- Flag稳定表达细胞株继续培养至一大培养瓶，长满时收取细胞，加500 VLRIPA裂解液（450LL RIPA+50 VL蛋白酶抑制剂），超声波破碎细胞，4℃、12 000 r/min离心10min；将带有Flag标签抗体的琼脂糖珠(anti- FlagM2 Afficity Gel)用1 mL预冷的洗脱缓冲液洗涤3次，将琼脂糖珠加入细胞裂解液中，4℃缓慢摇动过夜，次日于4℃、3000 r/min离心1 min，收集琼脂糖珠与目的蛋白复合物，用预冷的洗脱缓冲液洗涤3次，1mL/次；用30 VL 2x上样缓冲液将琼脂糖珠轻轻悬起，煮样，Western印迹检测。
2 结果
2.1 构建pCas-XRCC6载体和pXRCC6-Donor载体
利用Blue Heron网站软件对XRCC6基因终止密码两侧约60 bp的序列进行分析，设计gRNA序列，选出3条gRNA（表1），分别连接到pCas- Guide载体（图1），构建pCas-XRCC6Ul、pCas-XRCC6U2．pCas-XRCC6U3载体，分别转化大肠杆菌，提取质粒测序，测序结果与设计一致。
根据GenBank中XRCC6基因序列设计同源臂序列并合成其扩增引物，以HeLa细胞基因组DNA为模板，PCR扩增得到500～600 bp的2条同源臂A1、A2（图2）。以同源臂A1、A2共同作为模板，以Flaglf和Flag4r为引物进行搭桥PCR扩增，得到约1100 bp的DNA片段B（图2）。片段B末端加碱基A后连接pBackZero-T载体，构建pXRCC6-Donor载体（图3）。以Flaglf和BlaRV为引物进行菌落PCR鉴定，经鉴定在1200 bp处有目的条带（图2），提取质粒测序，结果显示编辑XRCC6基因的供体DNA载体构建成功。
2.2稳定细胞株XRCC6-Flag筛选与鉴定
转染后第8d收集细胞提取蛋白质，Western印迹检测Flag标签序列插入XRCC6基因5 ’端的效率。图4显示，gRNAU2位点的Flag标签序列插入XRCC6基因的效率最低，gRNAU3位点的Flag标签序列插入XRCC6基因的效率最高。因此，选取pCas-XRCC6U3载体和供体DNA载体共转染HeLa细胞进行稳定株的筛选。
将pCas-XRCC6U3载体和pXRCC6-Donor载体共转染HeLa细胞10 d后，挑取单克隆于96孔板中继续培养，待细胞传代至6孔板中并长满时，Western印迹鉴定在蛋白水平上Flag标签序列是否插入XRCC6基因5 ’端，以p53-Flag质粒过表达的HeLa细胞全细胞裂解液为阳性对照。Western印迹结果(图5)显示，72号细胞株在相对分子质量约70xi03处有条带，即该细胞株为XRCC6- Flag稳定表达细胞株。鉴定100株细胞，共获得3株XRCC6- Flag稳定表达的细胞株。
为了进一步确定该细胞株为XRCC6-Flag稳定表达细胞株，分别提取该3株细胞株的基因组DNA作为模板，以Flag和Flag4r为引物检测Flag标签序列是否插入XRCC6基因5 ’端。PCR扩增得到约600 bp条带（图6），进一步证明Flag标签序列已插入XRCC6基因5 ’端。
2.3稳定细胞株XRCC6-Flag免疫共沉淀分析
制备HeLa细胞裂解液，用XRCC6( Ku70)抗体沉淀XRCC6蛋白，Western印迹检测结果表明免疫共沉淀后的全细胞裂解液上清液中仍有较多XRCC6蛋白残留（图7）。制备筛选获得的XRCC6-Flag稳定表达细胞株的全细胞裂解液，用anti-DDDDK- Tag (Flag tag)抗体进行免疫共沉淀XRCC6-Flag蛋白，Western印迹检测结果显示免疫共沉淀后的全细胞裂解液上清液中几乎没有残余目的蛋白（图7）。结果表明利用Flag标签抗体的特异性可以实现对XRCC6-Flag稳定表达细胞株中Ku70蛋白更好的沉淀，效率远远高于用Ku70抗体免疫共沉淀内源的XRCC6蛋白。
3讨论
XRCC6蛋白(Ku70)参与非末端同源重组修复，与Ku80蛋白形成二聚体，结合到损伤断裂的DNA末端，参与DNA损伤修复。Ku70/Ku80复合体不仅在维持基因组完整性中起重要作用，在DNA复制、细胞凋亡、端粒结构的维持和基因转录调控中期也有重要作用。此外，Ku70还是一个肿瘤抑制因子，但是其作用机制尚不明确。
我们利用CRISPR/Cas系统对XRCC6基因5 ’端进行编辑，gRNA与靶序列结合，引导Cas9核酸内切酶将XRCC6基因5 ’端的双链DNA断裂，转染进入细胞的供体DNA序列提供修复模板，细胞利用同源重组修复方式将断裂位点修复，从而将Flag标签序列插入XRCC6基因5 ’端。免疫共沉淀结果显示，anti-DDDDK-Tag抗体的沉淀效果比Ku70抗体的沉淀效果好。因此，在研究某些不常见蛋白或抗体效率低的蛋白时，利用在基因组中插入标签的方法，可以解决抗体效率低的问题。而且Flag标签蛋白由24个碱基编码而成，分子很小，在Ku70蛋白后加Flag标签不会影响Ku70蛋白的功能。在大规模筛选前，针对不同DNA序列位点构建的载体，在转染细胞后于蛋白水平进行初步检测，根据Western印迹结果，选择插入效率较高的位点载体进行稳定细胞株的筛选，可以减少工作量，提高效率。除了在蛋白表达水平进行鉴定外，对在蛋白水平鉴定出的XRCC6-Flag稳定细胞株提取基因组DNA，以Flag和Flag4r为引物进行PCR扩增，在蛋白水平和基因组水平上双重验证了Flag标签已插入XRCC6基因组。XRCC6-FLag稳定表达细胞株的获得，为深入研究XRCC6基因及其蛋白的生物学功能提供了有效细胞模型。
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