响应面法优化提取罗布麻可溶性膳食纤维的工艺研究

  俞莹1,2，薛菲1，2，3，刘顺刚1,2，曹洁霞1，2
   1．江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室（盐城224051）；2盐城师范学院生命科学与技术学院（盐城224051）：3．江苏省盐土生物资源研究重点实验室（盐城224051）
摘要以罗布麻为原料，采用双酶法（植物蛋白酶和糖化酶）从中提取可溶性膳食纤维。在单因素试验的基础上，采用响应面分析法，选取料液比、植物蛋白酶酶解温度和酶解时间为自变量，可溶性膳食纤维提取率为响应值，确定罗布麻叶中SDF的最佳提取条件为：料液比1：25 (g/m L)、植物蛋白酶酶解时间3.8 h、酶解温度54.7℃、添加量8%以及糖化酶添加量1.0%在此条件下SDF的提取率为38.12%。
关键词  罗布麻叶；可溶性膳食纤维；提取工艺；响应面分析
   罗布麻（Apocynum venetum L．）隶属夹竹桃科( Apocynaceae)，为多年生直立草本或灌木，是一种稀有的野生植物，自古以来就被国人誉为仙草。罗布麻是一种盐碱地指示植物，是江苏滩涂蕴藏量最高的药用盐生植物之一，具有清热泻火、平肝熄风、养心安神和利尿消肿的作用。其叶子中含有大量黄铜、多糖、多酚和膳食纤维等化学成分，是治疗高血压的中药材之一。
   膳食纤维一般指包含纤维素、半纤维素、树脂、果胶及木质素等成分，在人体中不易被消化吸收的多糖类食物成分，主要存在于植物的细胞壁中。根据膳食纤维的溶解性不同，它包括可溶性膳食纤维( SDF)和不溶性膳食纤维(IDF) 。膳食纤维对人的生理具有积极的促进作用，包括通便、降血脂和降血糖等。
   近年来，对罗布麻叶化学成分方面的研究，主要为无机元素，而有机成分仅限于对其营养成分和总黄酮提取测定方面的研究；对于药理活性方面，集中于抗炎、增强机体免疫、降脂、抗氧化活性及花粉过敏原性等方面的研究。关于罗布麻叶SDF提取工艺及其抗氧化活性方面鲜见相关报道，因此，主要研究罗布麻叶中可溶性膳食纤维的提取条件，通过优化条件，获得最高提取率，为后续抗氧化活性的研究提供前期准备。
1  材料与方法
1.1材料与试剂
     罗布麻，采摘于盐城市沿海滩涂自然保护区；木瓜蛋白酶（100 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇等，均为分析纯。
1.2主要仪器与设备
   JJ-2组织捣碎机：上海康华生化仪器制造有限公司；EL204电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PHS-3C精密酸度计：上海康华生化仪器制造有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：金坛市三和仪器有限公司；DZF-OB真空干燥箱：上海跃进医疗器械厂；SHB- Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸易有限公司；TGL-16gR高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；旋转蒸发器：上海豫康科教仪器设备有限公司。
1.3方法
1.3.1  罗布麻叶SDF提取工艺流程
     罗布麻叶干燥至恒重 →粉碎-过筛（40目）→称取样品1 g→加磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 6.6)溶解、调pH至7.0~加入植物蛋白酶、酶解→灭酶( 100℃，5 min) →调pH至4.0～4.6之间、加入糖化酶、酶解（酶解温度60℃）→灭酶( 100℃，5 min) →（用
两层纱布过滤）离心(9 000 r/min，4 min)取滤液浓缩至5 m L→醇析（4倍体积95%热乙醇）→离心(9 000 r/min，4 min)、取滤渣、洗涤滤渣（用丙酮、78%乙醇）→干燥至恒重即为SDF、计算SDF提取率。
1.3.2  SDF提取率的计算
     SDF提取率=提取所得的SDF质量(g)／样品质量(g) x100%    (1)
1.3.3  罗布麻叶SDF提取条件优化
     选择对SDF提取率有影响的料液比、植物蛋白酶酶解时间、植物蛋白酶添加量、植物蛋白酶酶解温度和糖化酶添加量五个因素，通过单因素试验考察其对SDF提取率的影响，选取其中影响最显著的三个因素，采用Box-Benhnken设计试验，以可溶性膳食纤维提取率作为响应值，做3因素3水平的响应面分析试验。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1  料液比对SDF提取率的影响
     设定植物蛋白酶添加量6%，在50 ℃下酶解4h，糖化酶添加量1.0%，分别按照料液比1：10，1：15，1：20，1: 25和1：30( g/m L)提取SDF，考察料液比对SDF提取率的影响，结果如图1所示。

     从图1可以看出，随着料液的增加，SDF提取率先是呈上升趋势，后呈下降趋势，在1：25( g/m L)处的提取率最高，为27.23%。因此确定设计料液比在1：25( g/m L)左右为宜。这与刘铭等的研究结果一致，有可能是因为料液少时溶解度低，反应体系较为黏稠，酶与底物接触不够充分；但当料液过多时，底物浓度过低，酶被稀释，使底物与酶之间的结合受阻，因此SDF提取率随着料液比呈先升后降的趋势。
2.1.2植物蛋白酶酶解时间对SDF提取率的影响
   设定料液比为1：25(g/m L)，糖化酶添加量1.0%，植物蛋白酶添加量6%，酶解温度50 ℃，分别酶解2，3，4，5和6h，计算SDF提取率，结果如图2所示。

     从图2可以看出，随着酶解时间的增加，SDF提取率呈先升高后降底的趋势，其原因可能是随着酶解时间的增加，酶与底物接触更充分，但当酶解时间过长时，部分SDF溶解损失。在4h时，SDF得率最大，为26.65%。因此确定蛋白酶酶解时间为4h左右。
2.1.3植物蛋白酶添加量对SDF提取率的影响
   设定料液比为1：25(g/m L)，糖化酶添加量1.0%，植物蛋白酶酶解温度50 ℃，酶解4h，分别按照植物蛋白酶添加量4%，6%，8%，10%和12%，提取SDF，考察植物蛋白酶添加量对SDF提取率的影响，结果如图3所示。

     从图3可以看出，随着植物蛋白酶添加量的增加．SDF提取率不断增加，当添加量为8%时，达到最大提取率为29.17%，此后随着植物蛋白酶含量的增加，SDF提取率逐渐降低。这是因为蛋白酶添加量增加促进了SDF的溶出，从而相应提高了SDF的提取率，但过多的蛋白酶又降低了SDF的聚合度，导致提取率下降。因此8%为SDF提取的最佳植物蛋白酶添加量。
2.1.4植物蛋白酶酶解温度对SDF提取率的影响
   设定料液比为1：25(g/m L)，糖化酶添加量1.0%，植物蛋白酶添加量8%，酶解4h，分别于40 ℃, 45℃．50℃，55℃和60℃对蛋白酶进行酶解提取SDF，考察植物蛋白酶酶解温度对SDF提取率的影响，结果如图4所示。
 

从图4可看出，植物蛋白酶酶解温度在55℃时，SDF提取率最高，达37.79%。这主要是因为酶解温度过低时，蛋白酶活性较低，与底物接触不充分，酶解温度过高时，蛋白酶又容易失活，故而提取率也较低。因此，55 ℃为适宜的蛋白酶酶解温度。
2.1.5糖化酶添加量对SDF提取率的影响
   设定料液比为1：25( g/m L)，植物蛋白酶添加量8%，55 ℃酶解4h，分别加入糖化酶0.6%，0.8%，1 .0%，1.2%和1.4%，考察其添加量对SDF提取率的影响，结果如图5所示。

   从图5可看出，随着糖化酶添加量的增加，SDF提取率也在增加，当添加量为1%时，SDF提取率达34.14%，为最高，糖化酶添加量超过1%后，SDF提取率迅速下降。因此，确定1%为SDF提取率最高时的糖化酶添加量。
2.2响应面优化罗布麻叶中SDF的提取条件
2.2.1响应面试验结果
   在单因素试验的基础上，通过方差分析得知对SDF提取率影响最为显著的三个因素为：料液比、植物蛋白酶酶解时间和酶解温度，对其做3因素3水平的响应面试验，试验设计及结果见表1。

2.2.2回归方程的方差分析
   根据表1试验结果，应用Design Expert软件对响应值进行分析，得到回归方程：Y=37.52-0.81A-1.83B-0.59C-0.35AB+1.5AC+0.91BC- 7.3 1A2-5.37B2-9.482,回归方程的方差分析结果如表2所示。

   由表2可知，回归模型极其显著( p <0.001)，而失拟项不显著(p>0.05)，说明该回归模型与实测值能较好地拟合；在影响SDF提取率的因素中，A、A2、B2、C2对罗布麻叶中SDF的提取影响极其显著，B的影响高度显著，AC的影响显著，其他项影响不显著。由F值的大小可以推断出所选因素范围内对罗布麻叶SDF提取率的影响次序为：料液比>植物蛋白酶酶解时间>酶解温度。
2.2.3  响应面分析
     根据表2的回归分析结果，利用Design Expert软件作相应响应面图，见图6～8。

     通过软件分析得出罗布麻叶SDF最佳提取工艺为料液比1：25( g/m L)、植物蛋白酶酶解时间3.83 h和酶解温度54.69 ℃，SDF提取率理论值为38.19%。结合实际操作的可行性，在料液比1：25( g/m L)、植物蛋白酶酶解时间3.8 h和植物蛋白酶酶解温度54.7℃下进行验证试验，重复三次，取平均值，得到的SDF提取率为38.12%，与最优理论值基本相符。
3结论
     采用双酶法提取罗布麻SDF的最佳提取条件为：料液比1：25(g/m L)、植物蛋白酶酶解时间3.8h、酶解温度54.7 ℃、添加量8%以及糖化酶添加量1.0%。在此条件下SDF的提取率为38.12%。