外加碳源对菌株GH10降解BDE-209的影响

赵银平  赵晓祥  杨伟  王玥

（东华大学环境科学与T程学院，上海201620）

  摘要：通过研究6种外加碳源对菌株GH10降解BDE-209产生的影响，证明葡萄糖是菌GH10降解BDE-209的最佳外加碳源，降解培养基中葡萄糖的最适浓度为2 mg/L。经过5d的降解培养，在第3天时培养基中BDE-209的残余浓度最低，其浓度从10 mg/L降为1.24 mg/L;与不添加葡萄糖的试验相比，BDE-209的降解率从42.24%提高到87.61u/0；菌株GH10对BDE-209的降解符合一级反应动力学，降解动力学方程为C=12.064e-0.67U，半衰期为1.03 d，说明添加葡萄糖能够有效促进菌GH10降解BDE-209。

  关键词：菌株GH10；BDE-209；降解率；外加碳源；葡萄糖

  多溴联苯醚( polybrominated  diphenyl  ethers，PBDEs)作为一类高效添加型溴系阻燃剂，被广泛应用于各种电子、电器、纺织、建材、塑料等产品中。此类产品在大量生产、使用和废弃的过程中，均不同程度的造成PBDEs进入各种环境介质中，如水体、大气、沉积物及污泥、鸟类、人体血液、母乳等。据研究表明，PBDEs可引起生物体的神经毒性、内分泌干扰毒性等，甚至还具有致癌性，因此环境中的PBDEs严重威胁人类健康及生态安全。

  多溴联苯醚中的五溴联苯醚和八溴联苯醚已被世界所禁用，而十溴联苯醚（BDE-209）还在使用中，这就引起人们对BDE-209的高度关注。BDE-209具有溴化程度高，阻燃性能好，价格低等优点，是目前使用最多的一种阻燃剂，因此环境中BDE-209的含量也在呈增加趋势。PBDEs的溴化程度越高，分子越稳定，并且BDE-209的分子结构对称，所以BDE-209是最稳定的PBDEs。同时BDE-209具有低挥发性、环境稳定性、脂溶性等特点，能够对生物体产生各种毒性，所以环境中BDE-209的降解已成为环境科学研究的热点。目前，BDE-209的降解方法主要有光降解法、零价铁法及生物法等，光降解过程会产生多溴二苯并二噁英及多溴二苯并呋喃，造成二次污染，并且成本较高，不适宜工程应用；零价铁降解过程会出现铁屑结块、沟流等现象，降低处理效果；生物法投资少、降解过程不会对环境产生二次污染，被认为是最有前景的降解方法。该研究采用微生物法对BDE-209进行降解，以本课题组筛选的降解高浓度BDE-209的长野雷夫松氏菌GH10作为实验菌种，采用固相萃取法和高效液相色谱法提取和测定降解体系中的BDE_209，研究外加碳源对菌株GH10降解BDE-209产生的影响，为环境中BDE-209的降解提供一定的理论依据及实验基础。

1实验部分

1.1实验材料

1.1.1培养基

  (1)LB液体培养基：鱼粉蛋白胨，10 g；酵母粉，5 g；氯化钠，5 g；去离子水，1 000 mL；pH=7.0。向LB液体培养基中加入2%的琼脂即可得到LB固体培养基。

  (2)无机盐培养基(MSM):KH2P04，2.65 g;Na2HP04，4.26 g;MgS04 - 7H20,0.2 g;CaCl2 -2H20,0.02 g;FeS04'7H20，0.014 g；NH4C1，0.5 g；微量元素，l mL;去离子水，1 000 mL;pH=7.0。其中微量元素溶液组成为：FeS04 - 7H20,2.1 g;ZnCl2,0.07 g;CuS04 - 5H20,0.03 g;MnS04 -H20,0.06 g;CoCl2．6H20,0.19 g;(NH4)6M07024.4H20，0.024 g；去离子水，1000 mL。

  无机盐降解培养基：向无机盐培养基中加入一定量的浓度为1 000 mg/L的BDE-209-=甲基亚砜标准储备液，使得降解体系中BDE-209的浓度为10 mg/L。

  外加碳源无机盐降解培养基：向无机盐降解培养基中分别加入6种不同的外加碳源，控制外加碳源的浓度为5 mg/L，6种外加碳源分别是葡萄糖、麦芽糖、淀粉、鱼粉蛋白胨、酵母粉、牛肉膏，添加外加碳源的试验组分别命名为试验组1、试验组2、试验组3、试验组4、试验组5、试验组6。

1.1.2菌株来源

  实验中所用的长野雷夫松氏菌（Leifsoniashin -shuensis GH10，简称GH10）系本课题组筛选获得的能够降解高浓度BDE-209的菌株，其最适生长条件为30℃，pH=7.0，摇床转速150 r/min。

1.2试验方法

1.2.1菌种的活化及菌悬液的制备

  取1环保藏于甘油中的菌GH10直接在LB固体培养基上划线培养3d，然后挑取单菌落再一次划线培养3d，一共活化2次。最后挑取单菌落于LB培养基中培养48 h，此时菌GH10处于对数期，然后取适量菌液于6 000 r/min离心6min，收集菌体并用生理盐水洗涤菌体3次，以等体积的生理盐水重悬，即得菌悬液。

1.2.2  菌GH10对BDE-209的降解

  于250 mL锥形瓶中，加入无机盐降解培养基、外加碳源无机盐降解培养基45 mL，121℃高压灭菌25min。待培养基冷却到室温接入GH10菌悬液，接种量为10%。30℃，150 r/min摇床避光降解培养5d，每天各取样1次（取样前充分摇匀），每次取样2 mL，用2x2 mL二氯甲烷／正己烷（V/V=l：1）对培养基中残余的BDE-209进行洗脱，合并洗脱液后立即进行HPLC检测。以接人灭活的菌悬液的无机盐培养基为空白对照实验，每一处理设3个平行，重复2次。进行菌株GH10对BDE-209的降解动力学研究时，每0.5 d取样1次，共取样3d。

1.2.3  固相萃取法

  采用固相萃取法提取降解体系中的BDE-209，固相萃取仪：TSBEQ-CR1012，上海anpel科学仪器有限公司；固相萃取小柱C-18柱：HC-C18，200 mg/3 mL，上海anpel科学仪器有限公司。BDE-209的固相萃取过程为：先用2 mL二氯甲烷预洗C-18固相萃取小柱，于负压下抽干溶剂，再依次用3 mL甲醇和3 mL超纯水活化，活化过程要始终保持小柱床体湿润；然后将2 mL样品进行上样，之后用3 mL超纯水淋洗以去除吸附在床体上的杂质，并于负压下抽真空，直至C-18小柱床体完全干燥；最后用4 mL(2 mLx2)正己烷/二氯甲烷( V/V=l:l)对BDE-209进行洗脱，收集洗脱液。最终洗脱液过无水硫酸钠除水，之后经0.22 um有机滤膜过滤后进行检测。此法BDE-209的回收率为99.61%，相对标准偏差为2.84%。

1.2.4高效液相色谱法

  采用高效液相色谱法（HPLC法）测定降解体系中BDE-209的浓度，其检测条件为：高效液相色谱仪：LC-20AT．日本岛津公司；色谱柱：Inertsil ODS-3 C18(5um，250 mmx4.6 mm);检测波长：260 nm；柱温：30℃；流动相：V(乙腈)/V(水)=95：5，进行HPLC检测前应超声30 min以上以除去气泡；流速：1.2 mL/min；进样量：20 uL；进样方式：手动进样。此条件下BDE-209的出峰时间为24.57 min，采用HPLC法分别测定浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mg/L的BDE -209溶液，将测得的各浓度溶液相对应的峰面积(y)随BDE-209浓度(x)作图，建立BDE-209标准曲线，该标准曲线方程为y=16 578x-1 973.5，线性关系良好，相关系数R2=0.999 4。

1.2.5傅里叶红外光谱法

  采用傅里叶红外光谱法( FTIR)对BDE-209降解体系中基团的变化情况进行分析，检测条件为：分辨率为2 cm；波数范围为4 000～400 cm；溴化钾中萃取样品含量为20 uL，待溶剂挥发尽后进行检测。

2结果与讨论

2.1  无外加碳源时茵GH10对BDE-209的降解

经过5d的降解，菌株GH10在无机盐降解培养基中对BDE-209的降解效果见图1和图2。从图1中可看出试验的前3d，培养基中的BDE-209被菌株GH10快速降解消耗，由于该菌株是专门筛选的以BDE-209为唯一碳源进行生长和繁殖的微生物，所以经过很短暂的适应期后菌株GH10开始快速降解培养基中的BDE-209，在第3天时培养液中BDE-209的浓度最低，为5.78 mg/L，此时BDE-209的降解率达到最高，为42.24%(见图2)；第4天和第5天，培养液中的BDE-209的浓度略微升高，此时菌株GH10开始进入衰亡期，死亡率大于生长率，导致死亡的菌株GH10体内未被吸收分解的BDE-209释放到培养液中，从而导致培养液中BDE-209的浓度升高。

2.2  添加外加碳源时茵GH10对BDE-209的降解

无机盐降解培养基中添加6种外加碳源后菌株GH10对BDE-209的降解效果见图3。从图3中可看出，经过5d的降解培养，试验组1和试验组2中BDE-209的降解率均明显高于不添加外加碳源的试验组，试验组1和试验组2中BDE-209的浓度见图4。试验组1与不添加外加碳源的试验组降解情况一致，均在第3天时BDE-209的降解率达到最大，其降解率为60.12%，远高于不添加外加碳源的试验组的降解率(42.24%)，说明葡萄糖能够促进菌株GH10对BDE-209的降解，原因可能是菌株GH10在消耗葡萄糖时产生的酶能够促进自身对BDE-209的降解；试验组2在第4天时BDE-209的降解率达到最大，其降解率为51.37%，麦芽糖也能够促进菌株GH10对BDE-209的降解，但降解速率小于添加葡萄糖的试验组；添加其余4种外加碳源的试验组，在第5天时BDE-209的降解率达到最大，但BDE-209的降解率均小于添加葡萄糖和麦芽糖的试验组的降解率，略高于不添加外加碳源的试验组的降解率。

  在试验的第1天，添加6种外加碳源的试验组的BDE-209的降解率均小于不添加外加碳源的试验组，原因可能是菌株GH10优先利用外加碳源进行自身的生长和繁殖，只有少量的BDE-209被菌株GH10消耗降解；在试验组1，菌株GH10从第2天开始快速消耗降解BDE-209；在试验组2，菌株GH10从第3天开始快速消耗降解BDE-209，而添加其他4种外加碳源的试验组菌株GH10从第4天才开始消耗降解BDE-209，因为淀粉、酵母粉、鱼粉蛋白胨、牛肉膏均属于大分子物质，微生物在利用这些物质时，首先将大分子物质分解成小分子后才进行消耗利用，并且大分子物质相比于小分子物质能够为菌株GH10提供足够的的营养，因此在添加淀粉、酵母粉、鱼粉蛋白胨、牛肉膏等大分子物质的试验组里，菌株GH10优先利用外加碳源进行自身的生长和繁殖，在试验的前3d里，外加碳源能够为菌株GH10提供充足的营养，导致BDE-209的降解率较低，从第4天开始菌株GH10才开始快速消耗BDE-209。

  葡萄糖和麦芽糖是较好的外加碳源，能够有效促进菌株GH10对BDE-209的降解，其它外加碳源的促进效果不明显；添加葡萄糖时，菌株GH10能够高效降解BDE-209，并且在第3天时降解率达到最大，而添加其它外加碳源时，降解率达到最大时的时间要长于3d，因此葡萄糖是菌株GH10降解BDE-209的最佳外加碳源。

2.3  不同浓度的葡萄糖对菌GH10降解BDE-209的影响

向无机盐降解培养基中分别添加一定量的葡萄糖，使培养基中葡糖糖的浓度分别为0、0.5、1、2、3、4、5、10、100、1 000 mg/L，经过3d的降解培养，葡萄糖浓度为0、0.5、1、2、3、4、5、10 mg/L的试验组中BDE-209的降解效果如图5所示，葡萄糖浓度为100、1 000mg/L的试验组中BDE-209基本没有降解，高浓度的葡萄糖能够为菌GH10提供充足的营养，导致菌株GH10完全只利用葡萄糖进行生长繁殖。从图5中可看出，葡萄糖浓度为2 mg/L时，培养基中BDE-209的残余浓度最低，其浓度为1.24 mg/L，降解率为87.61%；葡萄糖浓度<2 mg/L时，BDE-209的降解率随着葡萄糖浓度的增加而提高；葡萄糖浓度>2 mg/L时，BDE-209的降解率随着葡萄糖浓度的增加而降低。

  浓度为2 mg/L的葡萄糖既能够使菌株GH10的菌体数量在短时间内达到一定的规模，又能够使菌株GH10在葡萄糖被耗尽后快速降解消耗BDE-209，使培养基中BDE-209的浓度降低；葡萄糖浓度<2 mg/L时，菌体数量不足，被菌株GH10消耗的BDE-209也较少；葡萄糖浓度>2 mg/L时，碳源比较充足，虽然菌体数量较多，但葡萄糖可以较长时间为菌株GH10提供能量使其生长繁殖，导致BDE-209在短时间内不能够被降解消耗。因此以葡萄糖作为外加碳源时，当其浓度为2 mg/L时，BDE-209的降解率最大。

2.4  菌株GH10对BDE-209的降解动力学

研究菌株GH10对BDE-209的降解动力学时，每隔12 h取样1次并测定培养基中BDE-209的残余浓度。采用Monod方程来描述BDE-209的降解效果，Monod方程的指数模型为C=Coe-'u，式中：Co为BDE-209的初始浓度，mg/L；C为BDE-209的残留浓度，mg/L；k为BDE-209降解速率的动力学常数；f为降解培养时间，d。无外加碳源和添加2mg/L葡萄糖时BDE-209的降解拟合曲线如图6、图7所示，从图中可看出2种条件下的拟合曲线均符合一级反应动力学，拟合曲线方程及各个参数见表1。

从表1可看出，在无外加碳源的情况下，菌株GH10对BDE-209的降解较为缓慢，半衰期为3.98d；而添2 mg/L葡萄糖作为共代谢基质后，BDE-209的降解速率有所提高，半衰期缩短至1.03 d。该动力学结果说明，添加外加碳源葡萄糖能够有效促进菌株GH10对BDE-209的降解效果。

2.5  BDE-209的降解机理

BDE-209被菌株GH10降解一定时间后，降解体系中基团变化情况见图8。3 433 cm-1处的峰来自于缔合O-H的伸缩振动；1631.7 cm-1处的峰来自于-C-C-的伸缩振动，根据BDE-209的结构推测，此为苯环中的-C-C-引起；560.7 cm-1处的峰来自于C-Br的伸缩振动，降解后此峰有所减小，由此推测BDE-209苯环上的Br被菌株GH10降解脱除，说明BDE-209的降解过程中存在脱Br作用。Deng等的研究表明，在好氧菌株DB1的作用下也存在脱溴作用，这与本研究有相似之处。

  BDE-209的生物降解过程可能和PCBs的降解机理相似，PCBs通过间位和对位脱卤生成低卤代PCBs ，菌株GH10可能在BDE-209的间位和对位脱溴生成低溴代的PBDEs，但是PCBs的生物降解过程涉及到PCBs的开环，而完全溴化的BDE-209很难被直接开环，因此BDE-209的生物降解机理最有可能是通过脱溴作用形成低溴代联苯醚，然后开环被进一步降解。

3结论

  通过研究菌株GH10对BDE-209的降解，表明BDE-209通过脱溴而被降解，并且6种外加碳源对菌株GH10降解BDE-209产生一定影响，结果表明葡萄糖能够最为有效促进菌株GH10对BDE-209的降解，培养基中葡萄糖的最适浓度为2 mg/L。在此条件下，经过5d的降解培养，在第3天时培养基中BDE-209的残余浓度最低，浓度为1.24 mg/L，与不添加外加碳源的试验相比BDE-209的降解率从42.24%提高到87.61%；菌株GH10对BDE-209的降解符合一级反应动力学，降解动力学方程为C=12.064e-0'670r，半衰期为1.03 d。