作者：张毅
花青素是黑青稞区别于普通白青稞的一类标志性成分，但目前关于黑青稞花青素种类及其活性的相关研究鲜有报道。因此，初步分析了囊谦县特色品种“囊谦黑青稞”中花青素种类及其抗氧化活性，以期为我国黑青稞产业发展和产品深加工提供科学依据。
1 材料与方法
1.1材料、仪器与设备
黑青稞样品为囊谦县特色品种“囊谦黑青稞”，白青稞样品为“北青3号”，均需要组织研磨仪进行粉碎。
DU 800紫外／可见分光光度计：德国贝克曼公司；旋转蒸发仪IKA-RVlO：德国艾卡公司；循环水式多用真空泵SHB-III:郑州长城科工贸有限公司；
721型分光光度计UNICO-JV2000。
1.2方法
1.2.1黑青稞花青素的提取
称取5 9黑青稞样品，料液比为1：20(g/mL)，溶剂为0.1%HC1溶液和95%乙醇(体积比为40：60)，提取温度50℃、提取时间3h，得到花青素提取液，然后经旋转蒸发仪浓缩样品至10mL，得到黑青稞花青素提取液。
1.2.2黑青稞花青素含量测定
1.2.2.1黑青稞花青素最大吸收波长的测定
取一定量花青素提取液用pH l.0缓冲液稀释至一定体积，使其吸光度在一定范围内，在200-800nm波长范围内进行全扫描，绘制吸收光谱图曲线。
1.2.2.2 pH示差法测定黑青稞花青素含量
花青素的色调和色度随pH不同发生改变，而干扰物质特征光谱不随pH的改变而改变。pH为1.0时，花青素以红色2-苯基苯并吡喃的形式存在，pH为4.5时，花青素以无色甲醇假碱的形式存在。结合朗伯一比尔定律可得出，在两个不同pH条件下，花青素吸光度差值与花青素含量成比例。因此通过两个pH条件、同一波长（以花青素最大可见吸收波长）下的吸光度差值，参考T Fuleki经验公式便可以测得花青素含量。
pH l.0缓冲液：准确称取1.49gKCI用蒸馏水定容至100mL，准确量取1.7mL浓盐酸用蒸馏水定容至100mL，配成0.2 mol/LHC1溶液，将KCI溶液与HCI溶液以25：67比例混合，用KCl溶液调pH为1.0±0.1。
pH 4.5缓冲液：准确称取1.64 9 NaAc用蒸馏水定容至100mL，用HCl调pH为4.5±0.1。
将花青素提取液分别用pH l.0的氯化钾一盐酸缓冲液、pH 4.5的醋酸钠一盐酸缓冲液稀释后，平衡1h后，用pH示差法测定吸光度。
1.2.2.3结果计算
式中：A—吸光度；ε一矢车菊花素—3—葡萄糖苷的消光系数，为26 900；L—光程，取1 cm；Mw—矢车菊花素—3—葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；DF—稀释倍数；V—待测花青素样品储备液体积，mL；m—干燥后黑青稞质量，g。
以蒸馏水作对照，用A700nm除样液混浊的影响。
1.2.3黑青稞花青素种类的高效液相色谱法分析
pH为1.0时，花青素以红色2-苯基苯并吡喃形式存在，pH为4.5时，花青素以无色甲醇假碱形式存在，所以当花青素从pH l.0变为pH 4.5时，吸光度会显著降低，而干扰物质特征光谱不随pH改变而改变。因此，通过观察两种pH下花青素吸光度的变化，定性分析花青素的种类。
色谱条件为：色谱柱，Shim-pack VP-ODS( 4.6mm×250 mm；5μm)；流动相A，水（用0.1%三氟乙酸调节pH）；流动相B，乙腈；A：B=82：18，检测器，DAD-3000．检测波长，515 nm，柱温35℃，流速0.5mL/min，进样量20 μL。
1.2.4黑青稞花青素抗氧化活性测定
1.2.4.1 DPPH自由基清除能力测定
参考Kim等的方法略有改动，39.4mg DPPH溶解到无水乙醇溶液中，定容至100mL，使用时稀释10倍配制成39.4mg/L，现配现用。分别取2 mL不同稀释度的花青素提取液，再加入2mL DPPH乙醇溶液，避光反应30min后以乙醇作对照，在波长515nm处测定吸光度，空白以相同体积乙醇代替样品反应，计算样品DPPH自由基清除率。L-VC为对照品，以VC(μg/mL)为横坐标，以DPPH自由基清除率(%)为纵坐标，得出线性回归方程：y=3.706x-3.682( R2=0.999 0)，线性范围为5-25μg/mL。
1.2.4.2 ABTS自由基清除能力测定
ABTS+．由5 mL 7mmo1/L ABTS溶液和88μL 140mmo1/L K2S208水溶液避光反应12-16 h后生成，当天使用。分别取0.5 mL不同稀释度的花青素提取液，再加入4.5 mL ABTS溶液混匀，避光反应6 min，以无水乙醇为对照测定吸光度，空白以相同体积水代替样品反应，计算样品ABTS+．清除率。L-VC为对照品，以VC（μg/mL）为横坐标，以ABTS自由基清除率(%)为纵坐标，得出线性回归方程：y=1.639x-2.906（R2=0.998 1），线性范围为5-60μg/mL。
1.2.4.3 总抗氧化能力测定
采用铁还原航氧化能力(Ferric reducing/antioxidantpower，FRAP)分析法评价黑青稞花青素的总抗氧化活性。FRAP溶液：2.5 mL 10 mmol/L的TPTZ工作液（用40 mmol/L的盐酸溶解），2.5mL20mmo1/L的FeCI3·6H20和25mL0.3mo1/L的醋酸缓冲液(pH3.6)。分别取1.0 mL不同稀释度的花青素提取液，加入FRAP工作液3mL，混匀，37℃水浴反应30min，于593 nm处读取吸光度，最终结果以FRAP值表示：1 FRAP单位=1 mmol/L FeSO4，即样品总抗氧化能力相当于FeSO4的mmol/L数。L-VC为对照品，以VC(μg/mL)为横坐标，FRAP值为纵坐标，得出线性回归方程：y=0.003x+0.008( R2=0.9981)，线性范围为5-45μg/mL。
2结果与分析
2.1 黑青稞花青素最大吸收波长
取一定量黑青稞花青素提取液，用pH l.0的氯化钾一盐酸缓冲液稀释，平衡th后，在200-800 nm波长范围内进行全扫描，绘制吸收光谱图曲线。如图l所示，黑青稞花青素最大吸收波长为515 nm。
2.2黑青稞花青素含量的测定
由图2所示，pH l.0变为pH 4.5时，黑青稞花青素类物质的吸光度显著降低，通过pH示差法测定黑青稞花青素结果如表1所示，平均含量为8.27mg/100g。
2.3黑青稞花青素组成的分析
当pH从1.0变为4.5时，花青素类物质的吸光度会显著降低，而干扰物质特征光谱不随pH的改变而改变。从图3和4可以明显看出，1-2号峰的吸光度明显减少，3-8号峰消失，由此可以初步推测黑青稞含有8种花青素类物质。
以矢车菊花素-3-葡萄糖苷为当量，8种花青素类物质所占花青素总量的比例如表2，其中2和1号花青素类物质含量较高，约占42. 57%和3 1.06%，二者总和所占比例为73.63%，而3，4，5，6和8号物质含量较低，且无明显差异，含量最低的为7号物质，仅为1 .47%。
2.4黑青稞花青素抗氧化活性分析
DPPH自由基清除法广泛用于评价物质的抗氧化能力。DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，抗氧化物质对DPPH自由的清除率与其具有的降低羟自由基、烷自由基或过氧化自由基的强度和能力有关。如图5 (A)所示，黑青稞花青素具有较强清除DPPH自由基的能力，花青素浓度在0.083-0.660μg/mL之间与自由基清除率呈良好线性关系，线性方程为：y=86.76x+12.82， R2=0.984 0。
ABTS自由基清除法目前已被广泛应用于亲水性和亲脂性物质总抗氧化能力的测定，ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+．。抗氧化物质会与ABTS+．发生反应而使反应体系褪色。如图5(B)所示，黑青稞花青素具有较强清除ABTS自由基的能力，花青素质量浓度在1.66-8.30μg/mL之间与自由基清除率呈良好线性关系，线性回归方程为：y=6.186x+ 25.12,R2=0.9220.
FRAP分析法的原理是抗氧化物质将Fe3+还原为Fe2+．Fe2+与三吡啶三吖嗪( TPTZ)结合生成蓝色络合物，在593 nm处有最大光吸收。吸光度越大，表明物质抗氧化活性越强。如图5 (C)所示，黑青稞花青素具有较强总抗氧化能力，花青素质量浓度在0.083-1.328μg/mL之间与FRAP值呈良好线性关系，回归方程为：y=0.127x+0.006，R2=0.9970。
与VC对照组相比，黑青稞花青素具有更强的抗氧化活性，如表3所示，DPPH自由基清除率为500-/0时，黑青稞花青素清除DPPH自由基能力是VC的33.76倍。ABTS自由基清除率为50%时，黑青稞花青素清除ABTS自由基能力相当于VC的8.03倍。当FRAP值为0.1时，黑青稞花青素总抗氧化能力是VC的41.44倍。
3结论
当机体氧自由基不能被及时清除，其内环境稳态失衡时，就会破坏生物大分子的结构和功能，导致细胞和组织器官损伤，并诱发各种疾病和加速机体衰老，如：心血管病、肝脏疾病、糖尿病、癌症、神经系统疾病、脑部疾病（老年痴呆、帕金森症）等。而通过食用含有花青素、多酚等天然抗氧化物质的功能食品，可以清除过多的自由基，维持机体内环境的动态平衡。
采用酸化乙醇法和pH示差法，对黑青稞花青素进行了提取及含量测定，结果表明花青素含量为8.27mg/100 9，并用HPLC法初步分析黑青稞花青素由8种成分组成。通过抗氧化试验发现，黑青稞花青素对DPPH、ABTS自由基清除能力和总抗氧化能力显著优于VC，分别是VC的33.76，8.03和41.44倍。总之，黑青稞花青素有强抗氧化活性，黑青稞可作为食品原料，应用于功能食品的开发，具有广阔的市场前景。摘要采用pH示差法测定了囊谦黑青稞中花青素含量，用HPLC法分析了囊谦黑青稞花青素种类，并通iiDPPH法、ABTS法和FRAP法评价了花青素的抗氧化活性。结果表明，囊谦黑青稞花青素含量为8.27 mg/100g，主要由8种花青素成分组成，对DPPH. ABTS自由基清除能力和总抗氧化能力显著优于VC，分别是VC的33.76, 8.03和41.44倍,具有强抗氧化活性。
黑色食品越来越受到人们的青睐，花青素是黑色食品重要的功能成分，具有抗氧化，抗衰老、抗癌、预防心血管疾病等多种药理活性。黑青稞是一类珍贵的种质资源，符合现代人对黑色健康食品的要求，具有潜在的应用开发价值。
4摘要采用pH示差法测定了囊谦黑青稞中花青素含量，用HPLC法分析了囊谦黑青稞花青素种类，并通iiDPPH法、ABTS法和FRAP法评价了花青素的抗氧化活性。结果表明，囊谦黑青稞花青素含量为8.27 mg/100g，主要由8种花青素成分组成，对DPPH. ABTS自由基清除能力和总抗氧化能力显著优于VC，分别是VC的33.76, 8.03和41.44倍,具有强抗氧化活性。
黑色食品越来越受到人们的青睐，花青素是黑色食品重要的功能成分，具有抗氧化，抗衰老、抗癌、预防心血管疾病等多种药理活性。黑青稞是一类珍贵的种质资源，符合现代人对黑色健康食品的要求，具有潜在的应用开发价值。
