制作复合真空冷冻干燥益生茵粉的新工艺

作者：郑晓敏 

    纳豆芽孢杆菌除了其众所周知的生理功能，如改善肠道菌群外，纳豆芽孢杆菌还具有良好的降胆固醇、溶血栓、抗氧化等功能，所以纳豆芽孢杆菌也是一种非常重要的益生菌资源。嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）具有维持宿主肠道微生态平衡、增强消化能力、增强免疫力、防癌抗癌等作用。它们目前已被广泛应用在保健食品、医药和食品等行业中，但由于在酸奶等液态或半固体状态下其活性都较难长期保存，而采用真空冷冻干燥技术将其制成活菌制剂是较为理想的一种保藏方法。但微生物细胞在真空冷冻干燥过程中极易造成冷冻伤害，其中主要为干燥伤害及冷冻伤害。主要是在真空冷冻过程中，细胞内的胞液的浓缩或冰晶的成长极易造成细胞伤害，所以采用某些物质作保护剂，使细胞在冷冻干燥过程中损伤减小是十分必要的。不同的保护剂对不同菌种的保护效果是不同的。

  对不同种类的保护剂的不同浓度进行了分析，以期最大限度地发挥保护剂的保护作用，减少菌体在冷冻干燥过程中的损伤死亡，提高菌体的存活率，旨在为研制开发高效冻干微生态制剂提供依据。

1  材料与方法

1.1菌种

  纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）：江西农业大学食品微生物实验室；嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）、两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum）：CGMCC。1.2仪器与设备

  SW-CJ-1FD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；摇床ZD-8802:江苏太仓华利实验设备有限公司；离心机AnkeLXJ-ⅡB：上海安亭科学仪器厂；恒温水浴锅HH-2:国华电器有限公司；电热恒温培养箱DH3600型：天津泰斯特仪器有限公司；真空冷冻干燥机FD-1D-50:北京博医康实仪器有限公司；紫外可见分光光度计WFZ UV-2100型：尤尼柯（上海）仪器有限公司；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅SYQ-DSX-280B型：上海申安医疗器械厂。

1.3分析方法

1.3.1菌体生物量的测定

  将未接种的相应培养基作为空白对照倾倒入比色杯中，选用600 nm波长分光光度计上调节零点，并对相应培养时间的菌体培养液进行测定，对浓度过大的菌悬液用灭菌后的液体培养基进行适当稀释，然后进行测定，使测定的OD值在0.10～0.65之间，经稀释后测得的OD值乘以稀释倍数为培养液的菌体生物量。

  活菌计数采用稀释平扳计数法计数。

1.3.2菌体的收集

  取出少量培养好的菌液进行镜检，确定无杂菌污染后，再将培养至稳定期初期的菌液置于离心机中，在4 000 r/min的转速下离心15 min，收集菌泥。

1.3.3试验流程

  保护剂↘

  菌种活化→耐酸、耐氧、耐胆盐驯化→扩大培养→离心收集菌体→悬浮液的制备→预冻→真空冷冻干燥→活化→稀释倒平板→恒温培养→统计计数

1.3.4单因素多水平分析

1.3.4.1脱脂乳粉添加量对菌体存活率影响

  取稳定期初期的菌体与浓度为3 %，5%，10%，15%和18%的脱脂乳粉，分别以1：3(g/m L)混和均匀，制成菌悬液，在-70 ℃预冷冻2h后，放入冻干机进行冻干：-50℃、真空度21 Pa条件下冻干24 h后，向菌粉中加入与冻干前等体积的生理盐水(0.85%)进行复水，采用稀释涂布平板法计算活菌数，除以冻干前的活菌数，计算其存活率，平行3次试验。

1.3.4.2葡萄糖添加量对菌体存活率影响

  取稳定期初期的菌体与浓度为1%，3%，4%，5%和7%葡萄糖，分别以1：3(g/m L)混和均匀，制成菌悬液，在-70℃ 预冷冻2h后，放入冻干机进行冻干：-50℃、真空度21 Pa条件下冻干24 h后，向菌粉中加入与冻干前等体积的生理盐水( 0.85%)进行复水，采用稀释涂布平板法计算活菌数，除以冻干前的活菌数，计算其存活率，平行3次试验。

1.3.4.3蔗糖添加量对菌体存活率影响

  取稳定期初期的菌体与浓度为1%，2%，3%，5%和7%的蔗糖，分别以1：3(g/m L)混和均匀，制成菌悬液，在-70℃预冷冻2h后，-50℃、真空度21Pa条件下冻干24 h后，向菌粉中加入与冻干前等体积的生理盐水(0.85%)进行复水，采用稀释涂布平板法计算活菌数，除以冻干前的活菌数，计算其存活率，平行3次试验。

1.3.4.4海藻糖添加量对菌体存活率影响

  取稳定期初期的菌体与浓度为5%，8%，10 %，12%和15%的海藻糖，分别以1：3(g/m L)混和均匀，制成菌悬液，在-70℃预冷冻2h后，-50℃、真空度21 Pa条件下冻干24 h后，向菌粉中加入与冻干前等体积的生理盐水(0.85%)进行复水，采用稀释涂布平板法计算活菌数，除以冻干前的活菌数，计算其存活率，平行3次试验。

1.3.4.5明胶添加量对菌体存活率影响

  取稳定期初期的菌体与浓度为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%明胶，分别以1：3(g/m L)混和均匀，制成菌悬液，在-70℃预冷冻2h后，放人冻干机进行冻干：-50 ℃、真空度21 Pa条件下冻干24 h，向菌粉中加入与冻干前等体积的生理盐水(0.85%)进行复水，采用稀释涂布平板法计算活菌数，除以冻干前的活菌数，计算其存活率，平行3次试验。

1.3.4.6甘油添加量对菌体存活率影响

  取稳定期初期的菌体与浓度为1%，2%，3%，4%和5%甘油，分别以1：3(g/m L)混和均匀，制成菌悬液，在-70℃预冷冻2h后，-50℃、真空度21 Pa条件下冻干24 h，向菌粉中加入与冻干前等体积的生理盐水(0.85%)进行复水，采用稀释涂布平板法计算活菌数，除以冻干前的活菌数，计算其存活率，平行3次试验。

1.3.5正交分析

  选择活菌率高的保护剂采用正交设计法进一步优化，以确定保护剂最佳组成，正交试验设计见表1。

2.1单因素多水平结果分析

2.1.1脱脂乳粉添加量对冷冻干燥菌体存活率影响

  试验结果见表4。试验结果表明，随着脱脂奶粉浓度的增加，纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌和嗜酸乳杆菌三种菌真空冷冻干燥存活率都先上升，但是当增加到一定浓度后菌体的存活率上升明显趋于缓和，根据菌体的存活情况，并从最佳经济效益角度考虑，脱脂乳粉对真空冷冻干燥纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌和嗜酸乳杆菌来说分别选择10%，10%和10%。

  由于脱脂奶粉类高分子保护剂溶于水后可使溶液呈现过冷状态，即在低于冰点的相同温度下溶液的溶质浓度较小，蛋白质不容易盐析变性。此外，它们减少了细胞暴露于介质与氧气的面积，而且又能在菌体表面形成一层保护层，减少因细胞壁的损坏而引起的胞内物质外漏，从而起到保护作用。

2.1.2葡萄糖添加量对冷冻干燥菌体存活率影响

  试验结果见表5。试验结果表明，随着葡萄糖浓度的增加，纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌和嗜酸乳杆菌三种菌真空冷冻干燥存活率都先上升，但是当增加到一定浓度后菌体的存活率上升明显趋于缓和，根据菌体的存活情况，并从最佳经济效益角度考虑，葡萄糖对真空冷冻干燥纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌来说分别选择5%，5%和4%，这是由于糖类的玻璃态温度较高，或者因为其含有一定数量的羟基，可替代水，使蛋白质的主相变温度维持在较低水平，从而起到保护作用。

2.1.3  蔗糖添加量对冷冻干燥菌体存活率影响

  试验结果见表6。试验结果表明，随着蔗糖浓度的增加，纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌和嗜酸乳杆菌三种菌真空冷冻干燥存活率都先上升，但是当增加到一定浓度后菌体的存活率上升明显趋于缓和，根据菌体的存活情况，并从最佳经济效益角度考虑，蔗糖对真空冷冻干燥纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌和嗜酸乳杆菌来说分别选择5%，4%和4%。

2 .1.4海藻糖添加量对冷冻干燥菌体存活率影响

  试验结果见表7。试验结果表明，随着海藻糖浓度的增加，纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌和嗜酸乳杆菌三种菌真空冷冻干燥存活率都先上升，但是当增加到一定浓度后菌体的存活率上升明显趋于缓和，根据菌体的存活情况，并从最佳经济效益角度考虑，海藻糖对真空冷冻干燥纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌和嗜酸乳杆菌来说分别选择10%，10%和10%。由于海藻糖能竞争性的结合蛋白质水化层中的水，使蛋白质结构变得更为紧密，不易受外界不利因素的影响，且在相同条件下，海藻糖的玻璃化相转变温度较高，可一定程度上稳定细胞膜及蛋白质结构、抗逆保鲜。海藻糖对嗜酸乳杆菌冷冻干燥存活率影响。

2.1.5  明胶添加量对冷冻干燥菌体存活率影响

  试验结果见表8。试验结果表明，随着明胶浓度的增加，纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌和嗜酸乳杆菌三种菌真空冷冻干燥存活率都先上升，但是当增加到一定浓度后菌体的存活率上升明显趋于缓和，根据菌体的存活情况，并从最佳经济效益角度考虑，明胶对真空冷冻干燥纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌和嗜酸乳杆菌来说分别选择2%，2%和2%。

2.1.6甘油添加量对冷冻干燥菌体存活率影响

  试验结果见表9。试验结果表明，随着甘油浓度的增加，纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌和嗜酸乳杆菌三种菌真空冷冻干燥存活率都先上升，但是当增加到一定浓度后菌体的存活率上升明显趋于缓和，根据菌体的存活情况，并从最佳经济效益角度考虑，甘油对真空冷冻干燥纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌和嗜酸乳杆菌来说分别选择4%，4%和5%。

2.2正交试验分析

  根据单因素试验分析选择对纳豆芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌真空冷冻干燥的存活率影响较大的保护剂进行正交试验。

试验结果如表10。表明，不同的因素对纳豆芽孢杆菌菌体的冷冻干燥的存活率影响不同。各因素对冷冻干燥后存活率的影响大小排列顺序：B>A>D>C，其最佳组合为：A1B3C2D3，即甘油为2%，脱脂乳粉为15%，明胶为2%，海藻糖为12%时取得最佳保护效果。

  试验结果如表11。表明，不同的因素对嗜酸乳杆菌菌体的冷冻干燥的存活率影响不同。各因素对冷冻干燥后存活率的影响大小排列顺序：C>A>B>D，其最佳组合为：A3B1C3D2，即海藻糖为12%，脱脂乳粉为5%，蔗糖为5%，明胶为2%时取得最佳保护效果。

  试验结果如表12。表明，不同的因素对双歧杆菌菌体的冷冻干燥的存活率影响不同。各因素对冷冻干燥后存活率的影响大小排列顺序：D>C>A>B，其最佳组合为：A1B3C3D3，即明胶为1.5%，脱脂乳粉为15%，海藻糖为10%，蔗糖为5%时取得最佳保护效果。

3结论

  通过单因素试验及L9(34)正交优化研究，结果表明，纳豆芽孢杆菌的最佳组合为：甘油2%，脱脂乳粉15 %，明胶2%，海藻糖12%；嗜酸乳杆菌的最佳组合为：海藻糖12%，脱脂乳粉5%，蔗糖5%，明胶2%；双歧杆菌的最佳组合为：明胶1.5%，脱脂乳粉15%，海藻糖10%，蔗糖5%。

4摘要  益生菌具有安全性、功能性和在胃环境中生存的能力。由于具有比其他天然产品更多的优势，益生菌已被广泛应用于有益健康的产品中。旨在开发一种具有多重保健作用的复合益生菌产品。分别采用纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、双歧杆菌(Bifidobacterium为菌株。培养的菌体经收集、洗涤后，力口入适当的保护剂，经真空冷冻干燥制成益生茵粉单体，再经复配制成复合益生菌粉制剂。通过单因素试验及

L9(34)正交优化。研究表明，纳豆芽孢杆菌的最佳组合是甘油为2%,脱脂乳粉为15%,明胶为2%,海藻糖为12%;嗜酸乳杆菌的最佳组合是海藻糖为12%,脱脂乳粉为5%，蔗糖为5%,明胶为2%双歧杆菌的最佳组合是明胶为1.5%，脱脂乳粉为15%，海藻糖为10%，蔗糖为5%。