关于正丁醇沉淀法分离小麦淀粉的探索

作者：张毅   

  使用丁醇沉淀法分离直链淀粉和支链淀粉，人们已经进行了有关研究。曾凡逵，李彬，吴平等分别对马铃薯淀粉、玉米淀粉、锥栗淀粉采用该方法进行了直链、支链淀粉的分离，结果显示效果都比较好。对直链、支链淀粉分离次数及效果的研究并不多，因此着重进行分析讨论，以促进我国直链、支链淀粉的深入研究以及淀粉工业的蓬勃发展。同时为后续“直链淀粉含量抗性淀粉得率的影响”试验做前期准备。

1  材料与方法

1.1材料与试剂

  小麦淀粉：陕西大河粉业有限公司；标准直链淀粉、标准支链淀粉：美国Sigma公司；氢氧化钠（分析纯）、氢氧化钾（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、正丁醇（分析纯）、异戊醇（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；碘化钾（分析纯）、碘（分析纯）：天津市东丽区天大化学试剂厂。

1.2主要仪器与设备

  UV-2600紫外分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；SC-3610离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；DZF真空干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；电子天平BS 324S万分：赛多利斯仪器有限公司；旋转蒸发仪RE 52A:上海亚荣升华仪器厂。

1.3试验方法

1.3.1小麦原淀粉水分含量测定

  采用GB 5009.3-2010中的直接干燥法，精密称量后，置101℃～105℃ 干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2～4 h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5 h后称量。然后再放入101℃～105℃干燥箱中干燥1h左右，取出，放入干燥器内冷却0.5 h后再称量。并重复以上操作至前后两次质量差不超过2 mg，即为恒重。

  试样中的水分的含量按式(1）进行计算。

  X  =(m1-m2)／(m3-m4)×100%  (1)

  式中：X-----试样中水分的含量，g/100 g；m1——称量瓶（加海砂、玻棒）和试样的质量，g；m2——称量瓶（加海砂、玻棒）和试样干燥后的质量，g；m3——称量瓶（加海砂、玻棒）的质量，g；m4——称量瓶（加海砂、玻棒）干燥后的质量，g。

  水分含量≥1 g/100 g时，计算结果保留三位有效数字；水分含量<1 g/100 g时，结果保留两位有效数字：

1.3.2原淀粉中直链淀粉与支链淀粉的比例的确定

  早期的测定多采用单波长法，事实上单波长法测定的是直链淀粉，因为只有直链淀粉与碘形成蓝色，而支链淀粉与碘的结合能力很弱，而且颜色呈紫红色。因为直、支链淀粉-碘复合物的吸收峰重叠，因此不能消除样品溶液中同时存在的支链淀粉与碘形成的紫红色复合物及其他背景的吸收。双波长法可以同时测定直、支链淀粉的含量，进而计算总淀粉含量。

1.3.2.1淀粉标准溶液配制

  称取50.0 mg标准直链淀粉，放入100 m L容量瓶中，加入1 mol/L NaOH溶液5 m L，在热水中溶解后，取出，用蒸馏水定容至100 m L，混匀，即为0.5 mg/m L直链淀粉标准溶液。取标准溶液0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1和1.3 m L分别置于25 m L比色管中，加15m L H2O以0.1 mol/L HC1调pH至3.5，加0.5 m碘试剂，定容，混匀，即得浓度为0，2，6，10，14，18，22和26 μg

/m L的直链淀粉标准溶液系列。

  同样方法制备支链淀粉标准溶液，考虑实际样品中支链淀粉的含量较高，因此配制标准溶液系列对分别取0.5 mg/m L支链淀粉溶液0，1，2，3，4和5m L，得到0，20，40，60，80和100 μg

/m L的标准溶液系列。

1.3.2.2确定测定波长与参比波长

  各选一适宜浓度的直链淀粉（20 μg/m L）和支链淀粉（60 μg/m L）标准溶液，分别在紫外一可见分光光度计上进行400～900 nm光谱扫描，将吸收曲线叠加绘制在同一个坐标系中。最大吸收波长为各自的测定波长；通过作图法分别得到各自的参比波长。

1.3.2.3双波长标准曲线的绘制

  将所配制的直链淀粉系列标准溶液分别在测定波长和参比波长处测定吸光度，以蒸馏水作空白，以浓度C为横坐标，以吸光度差值为纵坐标作直链淀粉标准曲线，并计算回归方程。

  同法做出支链淀粉的标准曲线和回归方程。

1.3.2.4含量计算

  根据所得直链淀粉与支链淀粉双波长标准曲线，计算原淀粉中直链淀粉与支链淀粉比例。

1.3.3直链淀粉与支链淀粉的分离与纯化

1．3.3．直链淀粉与支链淀粉的粗分离

  准确称取10 g干燥后的小麦淀粉，加入少量无水乙醇分散并湿润样品，再加入350 m L 0.5 mol/L的氢氧化钠，在沸水浴中搅拌20 min，使溶液清澈透明，无结团状，冷却后离心3 500 r/min 20 min，用2rnol/L的盐酸中和至中性，加入100 m L正丁醇-异戊醇(3：1)混合液，在沸水浴中加热搅拌10 min后，冷却至室温，于2℃~4℃的冰箱中静置48 h，取出，离心3 500 r/min 20 min，得到的沉淀物为粗直链淀粉，离心液为粗支链淀粉。

1.3.3.2直链淀粉的纯化

  将粗直链淀粉沉淀全部移人正丁醇饱和的200 m L水中，加热溶解至溶液透明，冷却至室温后放入2℃~4℃的冰箱中静置24 h，取出离心3 500 r/min，20min，将所得沉淀物按上述步骤重复操作10次（即重结晶10次），将沉淀物用无水乙醇洗涤数次后，真空干燥，即得纯化的直链淀粉样品。

  每次纯化后取样少许，洗涤干燥后置于干燥器，便于之后测定每次纯化后的含量。

1.3.3.3支链淀粉的纯化

  将2.2.1中的粗支链淀粉上清液置于分液漏斗中静置，取下层加入40 m L正丁醇-异戊醇(3：1)混合液，在沸水浴中加热搅拌至溶液分散透明，冷却至室温，移人2℃～4℃冰箱中静置48 h，离心3 500 r/min，20 min去除沉淀，用上清液重复上述操作10次（即重结晶10次）。将最终上清液加入2倍体积的无水乙醇沉淀，低温静置24 h后离心，将沉淀溶于热的200 m L0.5 mol/L的NaOH溶液中，离心去沉淀，中和。离心液中再加2倍体积的无水乙醇，将沉淀溶于200 m L蒸馏水中，用2倍体积的无水乙醇再沉淀，以无水乙醇洗涤数次，真空干燥得到纯化的支链淀粉样品。

  同样每次纯化后取样，洗涤干燥后置于干燥器。

1.3.4分离后，直链、支链淀粉蓝值的测定

  蓝值是表示淀粉结合碘能力的一个指标，直链淀粉由于其线性聚合度很高，6个葡萄糖分子就可以结合1个碘，蓝值很大，一般为0.8～1.2。支链淀粉的侧链链长只有14～30葡萄糖残基，与碘结合能力很弱，故蓝值较小，在0.08～0.22。测定方法采用Gibert和Spragg法。然后按式(2)计算：

  蓝值=A680×4／样品的浓度(mg/d L)  (2)

1.3.5直链、支链淀粉含量测定

1.3.5.1标准曲线制作

  将2.2中所配制的直链、支链淀粉系列标准溶液分别在各自最大吸收波长处测定吸光度，以浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，分别得到直链淀粉标准曲线与支链淀粉标准曲线，并计算回归方程。

1.3.5.2含量计算

  根据所得直链淀粉与支链淀粉标准曲线，计算每次纯化后取样的直链淀粉与支链淀粉含量。

2结果与分析

2.1原淀粉含水量

  经直接干燥法，测得原淀粉含水量为13.2%。

2.2原淀粉中直链淀粉与支链淀粉比例

  图1为直链、支链淀粉分别于碘结合后的颜色，图2为直链淀粉(20 μg/L)和支链淀粉(60μg /m L)标准溶液碘吸收光谱扫描图。可见小麦直链淀粉-碘与支链淀粉-碘吸收曲线存在明显的差异，说明二者与碘结合能力、结构存在较大差异。用作图法（图中虚线所示），可以得到直链淀粉与支链淀粉最大吸收波长分别为635和533 nm，参比波长分别为740和668 nm。

  图3显示，直链、支链淀粉的双波长标准曲线线性关系良好。经计算，得出小麦原淀粉中：直链淀粉含量为27.74%，支链淀粉含量为71.15%，原淀粉纯度为98.89%。

2.3链淀粉、支链淀粉分离过程

  直链淀粉与支链淀粉各经过10次纯化干燥后，得到纯化直链淀粉与支链淀粉拍摄照片见图4。

  从图4可以看出，制得的小麦直链淀粉经干燥后，边缘不规则，呈棉絮形。支链淀粉经干燥后，呈蜡质状。

  最终得到直链淀粉和支链淀粉分别为1.98 g和4.24 g，二者得率分别为19.8%和42.4%(原料为10.00g)。直链淀粉和支链淀粉的损失主要来自于进一步分离直链淀粉中的支链淀粉，和支链淀粉中的直链淀粉，另外与分离次数也有一定关系。并且可以看出在分离过程中，支链淀粉损失更大。

2.4蓝值

  测得最终分离得到的小麦直链淀粉和支链淀粉的蓝值为分别为1.08和0.15，均处于相应的分布范围内，表明纯化后的小麦直链淀粉和支链淀粉的纯度较高。

2.5直链淀粉与支链淀粉含量测定

  图5为直链淀粉最大吸收波长( 635 nm)处作出的标准曲线，据此测得直链淀粉每次纯化后其含量，如图6所示。可以看出直链淀粉纯化中，5次纯化之后其含量趋于平缓，7次纯化后纯度可以达到98.21%。

  图7为支链淀粉最大吸收波长( 533 nm)处作出的标准曲线，据此测得支链淀粉每次纯化后其含量，如图8所示。可以看出支链淀粉纯化中，6次纯化之后其含量趋于平缓，10次纯化后纯度可以达到98.25%。

3结论

  1)小麦原淀粉中，直链淀粉含量为27.74%，支链淀粉含量为71.15%。

  2)得到直链淀粉和支链淀粉的蓝值为1.08和0.15，二者得率分别为19.8%和42.4%。

  3)直链、支链淀粉在分离第6次之后效果趋于平缓，分离7次、10次后，纯度可以达到98%。

4)实验室中用丁醇沉淀法，在离心转速为3 500r/min，离心时间20 min的分离条件下，可以得到纯度很高的直链淀粉和支链淀粉。

4摘要  采用正丁醇反复沉淀法，对小麦淀粉中的直链淀粉和支链淀粉进行多次反复离心纯化，实现二者的分离。通过双波长法，测定了原淀粉中直链和支链淀粉的比例。测定了最终得到的直链和支链淀粉的蓝值，结果均在标准范围内。重点测定了分离次数与纯度的关系，分离次数分别达到7次、10次后，直链和支链淀粉的纯度可以达到98%。结果显示，该方法用于实验室分离小麦直链淀粉与支链淀粉效果显著。