作者：张毅
DHA是二十二碳六烯酸(Docosahexenoic acid)的简称，俗称脑黄金，是w-3（n-3）系长链多不饱和脂肪酸。DHA是人体大脑的主要组成成分之一，约占脑细胞脂肪酸的30%以上，是维持生理功能必不可少的物质，同时具有增强记忆、提高智力、降低血脂、调节免疫系统等功效。近年来，DHA行业迅猛发展，DHA市场需求量急剧增大，而鱼油中的DHA又受到海洋污染，资源不足，加工成本高等问题的影响。因此开发高效低廉的DHA生产工艺不仅有助于改善目前DHA研发生产现状，更可以促进其他多不饱和脂肪酸类产品的开发，利用海洋微藻发酵生产DHA成为当前的新途径。
裂壶藻是（Schizochytrium sp．）一类富含DHA的海洋微藻，因其生长速度快、易于培养、细胞内脂肪酸组成简单易于提纯等优势，被认为是一种极具潜力的DHA新来源。
通过对裂壶藻产DHA过程中其生物合成和代谢特性的一系列研究，以期建立裂壶藻营养生长与油脂合成和DHA产量变化的评定体系，获得最适的营养与代谢的基本信息，在此基础上考察50 L放大发酵试验，为工业推广提供理论依据。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
裂壶藻ATCC20888（Schizochytriumsp.），购自广东微生物菌种保藏中心。
1.1.2培养基
1. 1.2.1平板与斜面培养基
葡萄糖、谷氨酸钠、酵母膏、NaCl、KH2PO4、MgSO4、金属离子混合液、维生素混合液。
1.1.2.2种子培养基
葡萄糖、谷氨酸钠、酵母膏、NaCl、KH2PO4、MgSO4、Na2SO4、金属离子混合液、维生素混合液。
1.1.2.3发酵培养基
葡萄糖、谷氨酸钠、酵母膏、NaCl、KH2PO4、MgSO4、KC1、金属离子混合液、维生素混合液。
1.1.3试剂与仪器
Agilent 7890A气相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；SPX-150C恒温恒湿箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1F单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；YM75立式压力蒸汽灭菌器：上海三申医疗器械有限公司；RE-52C旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；HYQ-150S全温摇床：武汉汇诚生物科技有限公司。
1.2试验方法
1.2.1种子培养
从平板中挑取ATCC20888单菌落一环，转接于种子培养基中置于摇床上26 0C、180 r/min条件下培养2～3 d。
1.2.2摇床发酵培养
将种子液按10%的接种量转接于发酵培养基中，于26 0C、180r/min下震荡培养，每天取样测定其生物量、糖耗、氮耗、油脂产量和DHA产量，连续培养3批次取平均值。
1.3分析方法
1.3.1还原糖质量浓度的测定
菲林试剂法。
1.3.2氨基酸质量浓度的测定
甲醛滴定法。
1.3.3生物量的测定
裂壶藻的生物量以收集的细胞干重计。取一定体 积的培养液装入预先称重的离心管中，5 000 r/min离 心20 min，沉淀用蒸馏水清洗3次，置于干燥箱中，60 0C条件下烘干，称重（至恒重）。
生物量的计算公式：
生物量=干菌体(g)／发酵液(L) (1)
1.3.4油脂的提取及DHA含量的测定
将离心洗涤得到的藻泥与水按料液比1：1(g／m L)混合，用碱性蛋白酶和纤维素酶在60 0C下酶解 6 h，真空冷冻干燥至恒重，研磨成藻粉，用乙醚索氏抽提至藻体至无色，旋转蒸发残留溶剂，置于烘箱干燥至两次质量变化小于0.2 mg，计算油脂体积。取0.1 g藻油，加1 m L苯一石油醚(体积比为1：1)混合溶剂，再加1 m L 0.4 mol. L-1的KOH-CH3OH溶液，摇匀，在室温下静置8～10 min，然后加蒸馏水使醚层升至瓶颈部，待液层澄清后即可作色谱分析。
气相色谱分析条件：色谱柱，Agilent SP-2560（100 m×25 μm，0.2μm）；升温程序：100 0C保持4 min,以30C．min-1升温至230℃，保持20 min，载气(N2)流速25 m L．min-1，压力2.4 k Pa，进样量1VL；分流比15：1。
1.3.5无机盐浓度对裂殖壶菌的影响
在考察了裂壶藻生长发育的基本营养特征外，还研究了3种主要无机盐NaCl（0，1，2，3和4 g/L），MgS04 (0,2,4,6和8 g/L),KH2PO4( 4.0, 4.5,5.0, 5.5和6.0 g/L)对裂壶藻生长代谢的影响，以每毫升发酵液的DHA产量为指标，确定最佳工艺条件。然后在确定最佳工艺的基础上进行50 L发酵罐放大，考察其工业应用价值。
2结果与分析
2.1 裂壶藻代谢的基本特征
2.1.1糖氮代谢曲线
由图1可知，在发酵培养的前3d培养基糖耗为87.8%左右，氮耗为83.4%左右，说明前3d为裂壶藻利用营养物质的主要时期，糖耗的速率先慢后快，其生长速率达到最大，代谢旺盛；第3天以后，裂壶藻进入稳定期，开始积累胞内油脂，糖耗逐渐变慢，当第7天发酵结束时，发酵液中剩余残糖仅为5.12 g/L。糖耗为初始的92.47%。氮耗的速率先快后慢，培养的第1天，氮的消耗很大，可能是由于菌体处于分裂间期，需要大量合成核酸蛋白质等物质，为进入分裂期作必要的准备；第3天以后，裂壶藻进入稳定期，开始积累胞内油脂，氮耗逐渐变慢，在第6天，发酵液中氮浓度轻微上升，可能是部分菌体自溶导致自身营养组分的外泄所致，当第7天发酵结束时，发酵液中剩余残氮仅为0.21 g/L。氮耗为初始的88.33%。
2.1.2裂壶藻生物量、油脂产量和DHA产量的变化曲线
裂壶藻在一定条件下经摇瓶发酵、离心收集菌体、干燥称重，提取胞内油脂，脂肪酸组成分析，其变化规律如图2所示。
由图2可知，在第1天时由于种子刚被接入新的培养基，裂壶藻菌种处于停滞期，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，生物量增长较为缓慢，基本不积累油脂。
第2天进入对数期，菌体以几何倍数快速生长，生物量显著增加，油脂产量持续快速增长，但DHA的含量还很低，几乎可以忽略不计，可能是由于菌体在适应培养条件之后，菌体迅速生长繁殖，氮源大幅消耗，菌体开始大量积累次级代谢产物。
到第4天，菌种逐步进入稳定期，生物量变化不显着，菌体由自身生长转变为代谢产物的积累，细胞内开始大量积累油脂，DHA含量大幅度上升。
发酵至第7天生物量、油脂含量和DHA产量分别达到41.32 g/L，13.7 g/L和5.8 g/L。
2.2无机盐浓度对裂壶藻代谢的影响
2.2.1 NaCl浓度对裂壶藻生物量、油脂产量和DHA产 量的影响
氯化钠可维持菌体细胞的渗透压，调节细胞内酸 碱平衡，并通过控制细胞膜的流动性来影响细胞内脂 质合成。
由图3可见，低浓度的NaCl环境，不能维持菌体细胞所需的渗透压，而在高浓度的NaCl下，细胞为适应高盐的外界环境，细胞内DHA合成受到抑制，分裂速度下降，从而生长速率下降；在NaCl质量浓度为0～3 g/L范围内随着NaCl质量浓度的增大，裂壶藻生物量与其细胞内的油脂产量、DHA产量随之增加，并且在质量浓度为3 g/L时，裂壶藻DHA产量达到最大值。当NaCl质量浓度大于3 g/L，DHA产量开始下降。这可能是，NaCl质量浓度的变化，影响了细胞内相关酶系和酶活性的改变，从而影响了菌体细胞内油脂和DHA的积累。取最优NaCl质量浓度为3 g/L。
2.2.2 不同MgSO4浓度对裂壶藻生物量、油脂产量和DHA产量的影响
镁是生物体组成代谢所必需的元素，是裂壶藻代谢中一些关键酶的辅助因子（如己糖激酶、果糖激酶），同时也是维持电位差和渗透压的重要物质，极大地影响着生物体内的物质代谢。
从图4可见，培养基中的Mg2+浓度对裂壶藻细胞油脂积累有很大影响，随着Mg2+浓度的增加，裂壶藻的油脂产量也随之增加，当MgS04质量浓度大于6 g/L时，油脂产量和DHA产量又开始下降，可以看出较高盐度对菌体有一定的抑制作用。取最优MgSO4质量浓度为6 g/L。
2.2.3不同KH2PO4浓度对裂壶藻生物量、油脂产量和DHA产量的影响
磷是细胞生命存在的必需元素，是一系列重要化合物（如核苷酸、核酸、核蛋白、磷脂、ATP酶等）的组成成分，它对细胞的生理代谢发挥着不可忽视的重要作用。
从图5可知，当磷酸盐浓度增加时，裂壶藻生物量、油脂产量、DHA产量迅速增加，磷酸盐质量浓度大于4.5 g/L时，生物量不再增加、甚至开始小幅度下降，可能由于磷酸盐浓度会影响脂肪酸代谢中的某一关键酶的活性，对细胞造成毒害作用。取最优KH2PO4质量浓度为4.5 g/L。
2.2.4 50 L发酵罐试验
从图6可知，菌体在发酵罐中培养后的生物量、油脂产量和DHA产量小幅度优于在摇瓶中培养，可能是因为发酵罐培养条件易于控制，发酵罐传质传热更均衡。当培养至第2天时，菌体快速持续增长，伴随着生物量的增加，油脂产量也逐步积累；到第5天，生物量、油脂产量增长平缓，DHA产量开始有小幅度下降，大概是菌体已经逐步由稳定期进入衰亡期。所以应该在第5天放罐较为合适，此时DHA产量达到最大值，为6.27 g/L。
3结果与讨论
通过对3个批次的裂壶藻摇瓶发酵过程中的糖耗、氮耗、生物量、油脂产量、DHA产量进行生物学代谢研究，得到裂壶藻生物合成与产物代谢的基本特征和规律，为进一步的研究做必要的准备；然后研究了几种重要的无机盐离子对菌体生长和产脂的影响，在NaCl质量浓度为3 g/L，Mg2O4质量浓度为6 g/L，KH2PO4质量浓度为4.5 g/L的情况下进行50 L发酵罐中验证，DHA产量达到了6.27 g/L。研究结果表明，裂壶藻对培养基中碳氮的利用率相对较高，但目标产物产量还有较大的提升空间，可尝试通过定期补糖来解除初始营养过高的抑制作用；在培养基中添加合理比例的无机盐配方可代替复杂的人造海水，不仅能满足裂壶藻生长和产物积累的需求，还能显著地提高DHA产量，为降低生产DHA成本提供可能。
4摘要为了研究裂壶藻营养代谢和无机盐对其生长及产DHA的影响。首先研究了3A批次的裂壶藻发酵产DHA过程中的生物量、油脂产量、DHA产量、糖耗、氮耗的变化；然后探索了无机盐离子对产脂过程的影响，并在以上 最优条件的基础上在50 L发酵罐中进行验证，DHA产量达到最大值，为6.27 g/L，这为工业推广提供了理论依据，为降低生产DHA成本提供了可能。
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