作者：张毅
臭李子8～9月果实成熟时采收，鲜用或微火烘干。臭李子种子含油38.79%，可提炼工业用油；叶入药，起镇咳作用；叶中的挥发油，有杀虫作用。臭李子含有单宁。单宁具有多种功用，能与金属离子螯合，并能与自由基发生反应，从而表现出很强的抗氧化能力，同时还具有抗菌、抗病毒活性以及抗肿瘤活性，应用十分广泛。
目前常用水和乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂来提取单宁，有机溶剂能促进氢键断裂，易于游离到胞外，从而萃取到溶剂中，提取的方式多采用水煎煮或水浴加热。超声波具有空化、微射流及微声流等多级物理效应，能促使植物细胞组织破壁或变形而应用于一些油料、多酚等天然产物的提取，并取得了良好的效果。试验采用超声波辅助手段提取臭李子中单宁，并采用响应面法对提取工艺进行优化，以获取最佳的提取工艺。
1 材料与方法
1.1材料与仪器
臭李子购于长白山，钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、溴水、无水碳酸钠、水合没食子酸均为分析纯。
UV2300紫外分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；TB-214电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；XMTD-4000电热恒温水浴锅：北京市永先明医疗仪器厂；TGL-16G高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.2试验方法
1.2.1单宁含量的测定
1.2.1.1原理
以没食子酸为主的单宁类化合物可将钨钼酸还原成蓝色化合物，该化合物在765 nm处有最大吸收峰，其吸收值与单宁含量成正比，以没食子酸为标准物质，标准曲线法定量。
1.2.1.2试剂的配置
1)钨酸钠-钼酸钠混合溶液：称取50.0 g钨酸钠，12.5 g钼酸钠，用350 m L水溶解到1000 m L回流瓶中，加入25 m L磷酸，50 m L盐酸，充分混匀，小火加热回流2h，再加入75 g硫酸锂，25 m L蒸馏水，数滴溴水，然后继续沸腾15 min（至溴水完全挥发为止），冷却后，转入500 m L容量瓶中定容，过滤，置棕色瓶中保存，使用时稀释一倍。
2) 75 g/L碳酸钠溶液：称取37.5无水碳酸钠溶于250 m L温水中，混匀，冷却，稀释至500 m L，过滤到储备瓶中备用。
3)没食子酸标准储备液：准确称取0.110 0 g水合没食子酸，溶解并定容至100 m L，此溶液没食子酸质量浓度为1 000 mg/L。在冰箱2℃~3℃下可保存5d。
4)没食子酸标准使用液：分别吸取1 000 mg/L没食子酸标准储备液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 m L至100 m L容量瓶中，定容，溶解质量浓度为0.0，10.0，20.0, 30.0, 40.0和50.0 mg/L.
1.2.1.3样品预处理
样品解冻后，精确称取样品2g，清洗除籽后，超声波法辅助提取臭李子中单宁，吸取2.0 m L样品提取，8 000 r/min离心4 min，上清液备用。
1.2.1.4标准曲线的建立
吸取0.00，10.0，20.0，30.0，40.0和50.0 mg/L没食子酸标准使用液各1.0 m L，分别加5.0 m L的水，1.0 m L钨酸钠-钼酸钠混合溶液3.0 m L碳酸钠溶液，混匀，放置2h，以标准曲线0.0 mg/L为空白，在765 nm波长下测定标准溶液的吸光度，以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.1.5样品的测定
吸取1.0 m L样品提取液，分别加入5.0 m L水，1.0mL钨酸钠-钼酸钠混合液和3.0 m L碳酸钠溶液，显色，放置2h，以不加样品提取液为空白，在765 nm波长下测定样品溶液的吸光度。
1.2.1.6结果计算
试样中单宁（以没食子酸计）提取量按式(1)进行计算。
式中：Y-试料中单宁含量，mg/kg; p-试样测定液中没食子酸的浓度，mg/L; 10-试样测定液定容体积，m L; A-样品稀释倍数；m-试料质量，g。
1.2.2提取溶剂的选择
在探索性试验中以水，乙醇和丙酮水溶液为提取溶剂，对这3种常用溶剂的提取效果进行比较，以提取温度为50℃，时间80 min，料液比1：12(g／m L)，超声波功率40 W。选择50%乙醇和50%丙酮为溶剂，单宁提取量分别为192.45 mg/kg和209.73 mg/kg，而以水为溶剂的单宁提取量仅为172.18 mg/kg。由此可见，选择丙酮作为最佳的提取剂。
1.2.3单因素试验
以丙酮作为提取溶剂，探讨提取溶剂的浓度，超声波功率，处理温度和处理时间等因素对臭李子中单宁提取效果的影响。
提取时间80 min，温度50℃，超声波功率40 W，用浓度为30%，45%, 60%, 75%和90%的丙酮溶液作为提取液，研究不同浓度溶剂对臭李子中单宁提取效果的影响；提取时间80 min，丙酮溶液的浓度为60%，超声波功率40 W，选择30℃，40℃，50℃，60 ℃和70 ℃五个温度梯度进行试验，研究不同温度对臭李子中单宁提取效果的影响；以丙酮溶液的浓度为60%，提取温度50℃ ，超声波功率40 W，选择40, 60，80，100和120 min五个不同的提取时间研究对臭李子中单宁提取效果的影响；丙酮溶液的浓度为60%,处理温度50℃，处理时间80 min，设置超声波功率为20，30，40，50和60 W，比较不同超声波功率对臭李子中单宁波提取效果的影响。
1.3响应面试验设计
响应面试验设计为了使提取工艺更加科学，在单因素试验的基础上，根据Box-Behnkenfl11设计原则，选取提取溶剂浓度、提取温度、超声波功率和提取时间对单宁提取量较显著的四个因素，以单宁提取量为响应值，设计四因素三水平的响应面试验，响应面试验因素与水平表如表1所示。
2结果与分析
2.1 没食子酸标准曲线
图1为没食子酸标准曲线得回归方程：y=0.165 4x-0.084，其中R2=0.994 8。结果表明，测定值在0～5.0mg/L范围内线性良好。
2.2以丙酮溶液浓度为梯度进行单因素试验
随着丙酮浓度的升高，单宁提取量逐渐增大，但超过60%以后，增大趋势不是很明显，结果见图2。提取溶剂浓度达一定程度时，有效成分基本完全析出，此时继续增大料液比，更多杂质溶出，而且增加了生产成本。因此可选取50%～70%的丙酮溶液作为提取液。
2.3 以提取温度为梯度进行单因素试验
随温度升高提取率迅速增高，50℃附近时达到最大，结果见图3。这可能是在较高的温度条件下，由于超声波的机械效应和形成的微射流而使得单宁分子运动速度加快，易于氧化所造成的。因此可选择40℃~60℃为提取温度。
2.4 以超声波功率为梯度进行单因素试验
在20～40 W范围内单宁的提取量随超声波功率的增大而提高，超过40 W后降低，结果见图4。这可能是由于随着超声波功率增大，并且放出大量的热，体系中单宁分解的速度增加，故选用超声波功率为30～50 W。
2.5以超声波处理时间为梯度进行单因素试验
延长处理的时间会提高单宁提取量，但超过80min以后开始迅速降低，结果见图5。这是由于单宁分子在长时间超声波的作用下会迅速分解。因此可选用70～90 min作为超声波处理时间。
2.6 Box- Behenken试验结果及条件优化
2.6.1超声波辅助提取臭李子中单宁的响应面试验
以臭李子中单宁提取量(Y)作为指标，以提取溶剂浓度( X1)，提取温度（X2），超声波功率（X3），提取时间（X4）为试验因素，响应面优化试验设计表和试验结果见表2，试验结果方差分析表3，模型系数及显著性分析见表4。
分析结果如表3所示。回归模型F值为32.03，p <0.000 1，表现为“极显著”，因此可以使用该模型。失拟误差平方和为109.611 860，表现为“不显著”，表明该方程对试验的拟合情况好。且相关系数R2=0.969 7，接近1，这表明模型与实际情况吻合程度较高，预测值和真实值之间有较好的相关性，因此可用此回归方程对试验结果进行分析预测。从由F值可以得到各因素对单宁提取量影响从大到小的顺序依次为：提取温度（X2）>超声波功率（X3）>提取时间（X4）>提取溶剂浓度(X1)。
通过二次回归分析对试验数据进行回归拟合，确立超声波辅助提取臭李子中单宁的最优拟合二次多项式方程，其回归方程系数见表4中估值。由表4可知，以单宁提取量(Y)为因变量，以提取溶剂浓度（X1），提取温度（X2），超声波功率（X3）和提取时间（X4）的编码值为自变量的三元二次回归方程为：Y=-2 231.473 845+18.358 818X1+23.202 504X2+12.363 053X3+25.616 420X4-0.124 731X12+0.009 200X2X1-0.247 277X22+0.016 800 2X3X1-0.000 070 0X3X2-0.149 864X32-0.053 168X4X1+0.024 350X4X2-0.012 375X4X3-0.144 240X42。
图6~图1 1分别说明提取溶剂浓度，提取温度，超声波功率，提取时间两两之间的交互作用臭李子中单宁提取量的影响关系。从6个图可以看出，臭李子中单宁提取量最初会跟随这4个因素的逐渐增大而不断爬升；但是超过这4个因素在试验中选取的中心值时，臭李子中单宁提取量会随着因素水平的上升而下降。
比较这6个图，加之结合回归方程系数的显著性检验试验，可以清楚地得到这4个因素的交互作用对臭李子中单宁提取量的影响的显著程度，从而得出提取温度对臭李子中单宁提取量影响最大，曲面呈现比较陡，其次是超声波功率和提取时间，影响作用最低的因素是提取溶剂浓度，曲面整体表现较为平滑。
2.6.2响应曲面试验的最佳优化结果及试验验证
通过使用软件对试验得到的数据进行优化得到的最佳工艺条件为：提取溶剂浓度为61.20%，提取温度为51.94℃，超声波功率41.25 W，提取时间为80.13min。臭李子中单宁提取量为214.21 mg/kg。
2.7精密度试验
分别精密量取标准储备溶液1 m L，按照1.2.1.5中的方法重复5次，测定吸光度，求得RSD=3.28%，表明仪器精密度良好。结果见表5。
2.8重复性试验
按照2.6.2中所得的最佳超声波辅助提取条件提取样品中单宁，并按照1.2.1.5中的方法测定供试样品吸光度并计算单宁的提取量，做5次平行，结果见表6。由表6可知，测定结果的相对标准偏差( RSD)为0.83%，表明方法重复性较好。
2.9 回收率试验
取已测得单宁含量的臭李子提取液0.25 m L，再加1 g/L没食子酸标准储备溶液0.75 m L，按照1.2.1.5中方法测定吸光度并计算单宁含量，做5次平行，计算回收率。结果见表7。由表7可知平均回收率为99.94%，RSD为0.7%。
3结论
试验通过使用辅助的超声波能量加速提取臭李子中单宁及通过使用Design—Expert软件进行响应面优化，得出最佳工艺条件：提取溶剂浓度为61.20%，提取温度为51.94℃，超声波功率为41.25 W，提取时间为80.13 min。在此条件下，臭李子皮单宁提取量为214.21 mg/kg。对该结果进行3次验证，与软件优化的结论吻合性较好，因而具有较高的可信性。使用该方法的回收率为99.94%，相对标准偏差(RSD)为0.7%。该试验结果可以为在天然物质的提取生产上提供一定的实际意义。
4摘要研究了以超声波为辅助手段提取臭李子中单宁的试验条件。在单因素的基础上，用Box-Behnk。n组合试验设计来优化试验条件。以四因素三水平的响应面试验优化了单宁提取的最佳工艺条件。最佳条件如下：提取溶剂浓度为61.20%，提取温度为51.94℃，超声波功率41.25 W,提取时间为80.13 min,单宁提取量为214.21 mg/kg。采用钨酸钠一钼酸钠显色分光光度法测定臭李子中单宁。该方法的回收率为99.94%，相对标准偏差(RSD)为0.7%。结论，该方法简便准确，灵敏度高，重复性好。
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