作者：郑晓敏
激光是一种新型的光源，它具有高单色性、高定向性、极窄的频率密度和极短的发光时间等特性。紫外波段激光能量高，但对人眼产生的危害大、价格昂贵，红外和远红外波段激光功率大，能耗高，价格昂贵，而可见光波段激光成本相对低廉，技术成熟，应用广泛。因此，本研究以常见的铜绿微囊藻（Microcvstisaeruginosa）作为实验藻种，在可见光范围内研究了激光对铜绿微囊藻的抑制效果，及激光对铜绿微囊藻光合系统Ⅱ(PSⅡ)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和细胞亚显微结构的影响，由此探究激光对铜绿微囊藻的抑制机理。
1实验材料与方法
11实验材料
铜绿微囊藻FACHB -915取自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。采用BGIl培养基在三角瓶中培养，培养条件：温度(24±0.5)℃，光强2 000 lx，光暗时间比为14 h:10 h，手摇3次ld，实验均采用对数生长期的铜绿微囊藻（胞密度在6.5xl06_2.5xl07cells/mL之间）。
1.2实验方法
细胞计数：采用血球计数板法。铜绿微囊藻细胞光密度（OD60）测定：Cary60分光光度计（AgilentTechnologies公司）。
激光照射方法：取5 mL藻液于10 mL离心管（外壁包裹锡箔纸），激光器（铭辉科技公司，型号见表1）从管口竖直向下照射。
初级生产力及抑藻率的测定：采用黑白瓶法测定净初级生产力（以02计）。
净初级生产力[g(O2)／(m3·d)]_(DOt-DOo)/t;其中DOo为初始溶解氧，DOt为t时间后溶解氧，t为培养时间。
抑藻率(%)=（空白组净初级生产力一实验组净初级生产力）／空白组净初级生产力xl00%
光合活性的测定：取3 mL待测藻样，暗适应5 min，用Water-PAM(德国walz公司)测定其叶绿素荧光相关参数。
SOD的提取和测定：将藻液在5 000 r/min下冷冻离心15 min，弃上清液，加入浓度0.01 mo1/L，pH为7.2的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，在冰水浴中用JY92-IIN细胞粉碎机（新芝生物科技公司，功率200 W，工作4s间隙5s）破碎50次，在11 000 r/min下冷冻离心15 min，取上清液用于蛋白含量和SOD的测定。蛋白含量测定采用考马斯亮蓝-G250染色法。SOD按照生物试剂盒（南京建成生物试剂盒）说明书测定。
藻细胞形态结构观察：用PBS离心漂洗藻细胞2-3次，加入2.5%戊二醛固定，乙醇脱水，切片并染色，最后在透射电镜下观察并拍照。
数据处理里：采用Origin80作图，SPSSl9 进行统计分析。
2结果和讨论
2.1 不同波长激光对铜绿微囊藻抑制效果的比较
表2是功率50 mW的4种波长激光照射铜绿微囊藻30 min后测定的净初级生产力和抑藻率。可以看出，650 nm的红光激光的抑藻率高于其他3种波长。因此，650 nm红光激光的抑藻效果最好。
不同波长激光通过同一介质有不同的透射率，在可见光( 400-800 nm)范围内，黄绿光激光对血红蛋白透射率最低，而红光激光对细胞组织具有最强的穿透力。此外，铜绿微囊藻在可见光范围的吸收峰在430 nm和670 nm左右。说明红光激光对铜绿微囊藻细胞的透射率最高，而且铜绿微囊藻对红光激光具有很好的吸收效率，更容易对藻细胞产生胁迫，所以在相同的时间内红光激光的抑藻效果最佳。
2.2 不同照射时间下激光对铜绿微囊藻的抑制作用
表3为功率lW，波长650 nm激光照射0、2、4、6、8和10 min后测定的净初级生产力和抑藻率。可看出，随着激光照射时间增加，净初级生产力减小，抑藻率增大，照射10 min后抑藻率达到93 .88%。说明激光照射时间越长，抑藻效果越好；为验证激光抑藻效果的持久性，将激光照射5、10、15和20 min后的铜绿微囊藻接种并培养，图1为铜绿微囊藻恢复生长情况。与对照组相比，激光照射的藻样恢复生长受到不同程度的抑制，照射时间越长，藻细胞增长越慢。其中，激光照射5 min和10 min的铜绿微囊藻生长受到明显抑制，但仍然能够增殖，可能是激光向下透射铜绿微囊藻时光强逐渐减弱，当照射时间较短时，处于离心管底部的部分藻细胞并没有完全被破坏。激光照射15 min和20 min后铜绿微囊藻受到激光足够的能量胁迫，藻细胞彻底受到抑制，停止生长和繁殖，说明其细胞受到不可恢复的破坏。
2.3激光对铜绿微囊藻光合活性的影响
叶绿素荧光参数可作为逆境条件下植物抗逆反应的指标之一，强光可引起藻类光合作用的光抑制。激光作为一种能量高度集中的单色光可能对微囊藻光合系统产生抑制。实验发现，激光照射铜绿微囊藻10 min过程中，藻液温度可由26.5℃升高至40℃。为探究激光产生的热效应对铜绿微囊藻光合活性的影响，测定了650 nm激光照射铜绿微囊藻0、2、4、6、8、10 min和40℃水浴加热10 min后铜绿微囊藻PSⅡ最大光化学量子产量（FvlFm）（图2）。可看出，随着激光照射时间增加，铜绿微囊藻FvlFm呈减小趋势，照射10 min后为0；而水浴加热10 min后FvlF，n为0.325，略小于对照组(0.359)，说明热效应只能对铜绿微囊藻的光合活性产生十分轻微的影响，激光对铜绿微囊藻的抑制主要是由非热效应引起的。FvlFm的大小反映PSⅡ反应中心内禀光能转换效率，FvlFm值越大表示PSⅡ反应光能转换效率越高。说明激光照射会影响铜绿微囊藻PSⅡ光能转化效率，使光合作用得到抑制，当达到一定照射时间时铜绿微囊藻光合作用被完全破坏。
2.4激光对铜绿微囊藻SOD活性的影响
图3为激光照射不同时间后铜绿微囊藻SOD活性的对比，可以看出，随着激光照射时间增加，铜绿微囊藻SOD活性缓慢升高，照射15 min后达到最大值（18.25 U/mgprot）。SOD是生物体内抗氧化防御系统清除活性氧(ROS)的第一道防线，其活性受到．02-的诱导而升高，歧化．02-并产生H202，可有效清除生物体内的氧自由基，对机体起保护作用。当照射时间较短时，SOD随照射时间增加而增大，说明激光照射使微囊藻细胞受到氧化损伤，通过增加'SOD来减弱细胞内产生的氧自由基，从而减轻激光胁迫引起的活性氧伤害。在照射20 min后SOD完全突变为0，说明铜绿微囊藻细胞内SOD酶系统己经被过量．02-破坏，失去了抵御活性氧伤害的能力，铜绿微囊藻可能完全死亡。
2.5激光对铜绿微囊藻细胞结构的影响
如图4所示为激光照射0、5、7、10 min后微囊藻样品透射电镜下观察的细胞结构和形态变化。对照组图4(a)微囊藻细胞形态健康，胞质内类囊体光合片层含量丰富，中央拟核区明显。激光照射5 min(图4(b))和7 min(图4(c))后类囊体片层出现变形、断裂和间隙，核区出现空洞，核质往周围弥散，有大量伪空泡。照射10 min后，类囊体消失殆尽，细胞质固缩聚集，形成均质样颗粒，出现质壁分离现象。铜绿微囊藻类囊体片层外表面上附有藻胆体，其生理功能是捕获光的激发能，然后传递给光合作用片层中的叶绿素a，从而进行光合作用。说明激光能破坏类囊体结构，从而降低藻细胞色素的光能捕获和传递能力，最终使微囊藻细胞内能量转化和电子传递过程终止，细胞生长和代谢所需要的能量和有机物供应不足致使细胞死亡。此外，微囊藻细胞核区遭到破坏，使内部DNA等遗传物质受到损坏，细胞壁也遭受破坏，从而使细胞失去自我保护能力，加剧了藻细胞的死亡。
3结论
激光对铜绿微囊藻具有抑制作用。不同波长激光对铜绿微囊藻的抑制效果不同，650 nm红光激光对铜绿微囊藻的抑制效果最好。功率为lW，波长650 nm激光照射对数期生长的铜绿微囊藻10 min，抑藻率可达93.88%以上；用此激光照射15 min可完全破坏铜绿微囊藻的恢复生长能力。
激光的高定向性和高度集中的能量使激光能破坏铜绿微囊藻的光合系统，导致铜绿微囊藻光能转化效率降为0，从而彻底丧失光合活性；激光胁迫下，铜绿微囊藻细胞内部发生氧化损伤，．02-升高，藻细胞通过增加SOD来减弱氧自由基，照射时间过长时藻细胞失去氧化损伤防御能力，SOD降为0；激光可使铜绿微囊藻细胞类囊体、中央核区、伪空泡和细胞壁等结构遭到破坏，从而使细胞失去物质与能量转化能力、信息传递功能和抵御外界干扰能力，最终导致细胞死亡。
激光抑藻具有快速、高效、无污染，操作简单，后期维护方便等优点。但功率太大的激光器价格昂贵，技术还不够成熟，需要进一步研究和实践，并结合其他控藻方法进行优化，在湖泊和水库的蓝藻水华治理中具有广阔的应用前景。
4摘要：为探索激光抑藻的效果及其机理，研究了不同波长激光对铜绿微囊藻的抑制效果，探讨了激光对铜绿微囊藻光合活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和细胞形态结构的影响。结果表明，650 nm红光激光的抑藻效果最好；功率lW波长650 nm激光照射铜绿微囊藻lO min抑藻率达到93.88%；激光照射15 min的铜绿微囊藻生长不可恢复；激光照射lO min可破坏铜绿微囊藻光合系统，使最大光化学量子产量（FvlFm）降至0；激光照射15 min后铜绿微囊藻SOD活性升到18.25 U/mgprot，高于对照组（5.87 U/mgprot，P<0.05）；激光照射可破坏铜绿微囊藻细胞类囊体、拟核和细胞壁等结构。
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