关于黄秋葵多糖提取条件优化及多糖纯度检测的研究

作者：张毅                

     目前，提取中药多糖多采用水提醇沉淀法，这样得到的粗多糖中蛋白质含量较高，而据资料显示，粗多糖脱蛋白后其生物活性更高。

  试验以黄秋葵嫩果为原料，通过热水浸提、乙醇沉淀的工艺获得水溶性黄秋葵多糖，研究制备均一黄秋葵多糖的柱层析条件，并采用柱层析法对其中的多糖成分进行分级纯化。

1  材料与方法

1.1材料及试剂

  材料：黄秋葵。

  试剂：葡萄糖、苯酚、浓硫酸、正丁醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、胰蛋白酶(1: 250)、DEAE-纤维素、0.5%苯甲胺蓝、浓氨水。

112仪器与设备

  UV757CRT型紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；BS2-160自动部分收集器：上海青浦沪西仪器厂；HL-2D定时数据恒流泵：上海沪西分析仪器厂有限公司；RE-52A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；等。

1.3方法

1.3.1黄秋葵多糖的提取

  将烘干的黄秋葵粉碎过筛，于100℃水浸提两次，利用旋转蒸发仪浓缩，后加入3倍体积的95%（体积分数，下同）乙醇沉淀，4℃以下低温静置过夜，离心（转速4 000 r/min），沉淀加蒸馏水溶解，再次重复乙醇沉淀的步骤两次，最后一次得到的沉淀用少量水溶解。

1.3.2多糖含量的测定

  多糖标准曲线回归方程为：y=58.277x+0.014 1，相关系数：R2=0.995（x为葡萄糖的质量浓度，单位为mg/m L；y为吸光度）。

1.3.3蛋白质含量的测定

  得回归方程为：y=0.727 0x+0.440 2，相关系数：R2=0.998 7（x为蛋白质的浓度，单位为mg/m L;y为吸光度）。

1.3.4  DEAE-纤维素再生处理

  称DEAE-纤维素20 g于200 m L去离子水泡12 h，抽滤后用200 m L 1mol/L NaOH浸泡20 min，再用去离子水洗至中性，然后用200 m L 1 mol/L HC1浸泡20

min，重复3次，再用纯水平衡。

1.3.5筛选适合黄秋葵多糖吸附的pH

  取再生好的DEAE-纤维素各1g加入10 m L离心瓶中，加入不同pH的多糖溶液4 m L，振荡吸附3h后，测溶液中多糖、蛋白质浓度。

1.3.6分离纯化

  层析柱介质为DEAE-纤维素，将多糖的水溶液pH调为6上样，用不同pH，不同NaOH以及不同NaCl浓度进行洗脱。利用自动部分收集器分段进行收集。测多糖和蛋白质浓度并绘制出洗脱曲线，收集主要吸收峰中间部分。

1.3.7多糖纯度检验

  用滤纸进行层析，用体积比为60：40：5的正丁醇、浓氨水与水的混合液为扩展剂，展开7h，用0.5%甲苯胺蓝乙醇溶液染色，95%乙醇漂洗至背景无色。

2结果与分析

2.1黄秋葵多糖提取液中的多糖和蛋白质的含量

  通过考马斯亮兰法和硫酸-苯酚法分别测定黄秋葵多糖提取液的蛋白质的含量和多糖的含量，得出黄秋葵多糖提取液中蛋白质的含量为0.218 mg/m L，多糖的含量为13.48 mg/m L。

2.2适合黄秋葵多糖吸附的pH

  取再生好的DEAE-纤维素各1 g加入10 m L离心瓶中加入pH分别为5，6，7，8和9的多糖溶液4 m L，振荡吸附3h后，测溶液中多糖、蛋白质浓度，见图1。多糖浓度低的而蛋白质浓度高的说明吸附多糖效果好，由图1得适合黄秋葵多糖吸附的pH为6.0。

2.3分离纯化

  采用DEAE-纤维素柱进行层析，上样量为16m L，洗脱速度为0.16 m L/min，先后用纯水，浓度分别为0.2，0.6和1.0 mol/L NaCl，浓度分别为0.1和1 mol/LNaOH洗脱，测量各管多糖浓度得洗脱曲线，见图2。峰1是0.6 mol/L NaCl洗脱得到。峰2是1 mo/L NaCl洗脱得到。峰3，4是0.1 mol/L NaOH洗脱得到。

  采用DEAE-纤维素柱进行层析，上样量为25m L，洗脱速度为0.47 m L/min，先用纯水洗柱，用不同pH的0.6 mol/L NaCl18.0, 9.0和11.0再用0.1和1 mol/LNaOH洗脱，测量各管多糖浓度得洗脱曲线，见图3。峰5是pH为8的0.6 mol/L NaCl洗脱得到。峰6是1mol/L NaOH洗脱得到。

  采用DEAE-纤维素柱进行层析，上样量为25m L，洗脱速度为0.56 m L/min，先用纯水洗柱，分别用不同浓度的NaOH 0.05，0.1，0.3，0.5和0.7 mol/L洗脱，测量各管多糖浓度得洗脱曲线，见图4。峰7是纯水洗脱得到。峰8是0.05 mol/L NaOH洗脱得到。

  采用DEAE-纤维素柱进行层析，上样量为25m L，洗脱速度为0.47 m L/min，先用纯水洗柱，用0.6mol/L NaCl在pH分别为6和8时洗脱再分别用0.05和0.1mol/L的NaOH洗脱，测量各管多糖浓度得洗脱曲线，见图5。峰9是pH为6的0.6 mol/L NaCl洗脱得到。峰10

是0.05 mol/L NaOH洗脱得到。

2.4多糖的纯度检验

  以pH 6.0多糖溶液上样，上样量25 m L，先用纯水洗脱，再分别用0.05，0.1，0.3，0.5和0.7 mol/L NaOH进行分步洗脱，洗脱速度为0.47 m L/min，纸层析检验结果显示0.05 mol/L NaOH洗脱的多糖为一斑点，说明此多糖较均一。

3结论

  在四组纯化条件筛选中虽有多处出现单一对称峰，但是经纸层析检验后以pH 6.0多糖溶液上样，上样量25 m L，先用纯水洗脱，再分别用0.05，0.1，0.3，0.5和0.7 mol/L NaOH进行分步洗脱，洗脱速度为0.47 m L/min的洗脱条件下的层析效果较佳。摘要以黄秋葵嫩果为原料，通过热水浸提法，乙醇沉淀的工艺获得水溶性黄秋葵多糖，采用DEAE-纤维素离子交换柱纯化多糖，探讨不同pH，不同NaOH浓度和不同NaCl浓度对黄秋葵多糖的洗脱效果，初步确定合适的纯化条件为：以pH 6.0多糖溶液上样，上样量25 m L，先用纯水洗脱，再分别用0.05，0.1，0.3，0.5和0.7 mol/L NaOH进行分步洗脱，洗脱速度为0.47 m L/min,纸层析检验0.05 mol/L NaOH洗脱得较均-多糖。

4摘要以黄秋葵嫩果为原料，通过热水浸提法，乙醇沉淀的工艺获得水溶性黄秋葵多糖，采用DEAE-纤维素离子交换柱纯化多糖，探讨不同pH，不同NaOH浓度和不同NaCl浓度对黄秋葵多糖的洗脱效果，初步确定合适的纯化条件为：以pH 6.0多糖溶液上样，上样量25 m L，先用纯水洗脱，再分别用0.05，0.1，0.3，0.5和0.7 mol/L NaOH进行分步洗脱，洗脱速度为0.47 m L/min,纸层析检验0.05 mol/L NaOH洗脱得较均-多糖。