刘飞，李相昕，葛洪如，齐小芬，于殿宇*
东北农业大学（哈尔滨150030）
摘要试验研究发酵法制备大豆糖蜜中功能性低聚糖的工艺。首先对大豆糖蜜的主要成分进行了分析和测定，大豆糖蜜中糖分含量占总量的48.48%。试验研究了5种不同的酵母对糖蜜中蔗糖去除效果和功能性低聚糖的保留率，选择啤酒酵母103作为发酵菌种，通过单因素试验考察pH、温度、时间、糖蜜浓度和接种量对发酵效果的影响，再通过响应面对工艺条件进行优化：pH 5,0、温度33℃、时间11 h、糖蜜浓度4.0%、接种量3,1%。大豆糖蜜发酵液
中各糖分的保留率为：蔗糖10.3%、棉子糖81.0%、水苏糖92.5%，获得了功能性成分含量及纯度均较高的大豆低聚糖产品。
关键词发酵；低聚糖；响应面；保留率
大豆糖蜜是以低温脱脂豆粕为原料生产大豆浓缩蛋白过程中经溶剂萃取、浓缩而成的纯天然副产物。大豆糖蜜中的主要成分为低聚糖，含量为59%~62%，此外还有少量粗蛋白、脂类物质、灰分、大豆皂苷、大豆异黄酮、酚酸、果胶质、阿拉伯半乳糖等多种糖类。通常说的功能性低聚糖是指具有特殊生理功能，特别是有利于双歧杆菌增殖的—类低聚糖。
大豆低聚糖有很多有益的作用，如它能促进人体内的双歧杆菌的增殖，从而提高人体结肠的健康情况、降血压、增加寿命、降低胆同醇、减少结肠癌的发病率，由于大豆低聚糖有一些优秀的加工性能和生理功能的特点，使其在食品工业中广泛应用。尤其是大豆低聚糖低热值、低甜度的特点，它适用于保健食品，提高人民健康水平具有积极的作用。
从大豆糖蜜等原料中直接提取大豆低聚糖，往往因原料中蔗糖含量高，难分离，造成最终低聚糖产品蔗糖含量高，功能性成分含量较低，限制了其在一些特殊食品中的应用，而微生物发酵后的大豆糖蜜，蔗糖被微生物大量消耗，功能性成分含量高。大豆糖蜜作为发酵底物的利用在国外已经有很多报道。
试验对发酵大豆糖蜜精制功能性低聚糖的微生物进行筛选并对其发酵工艺进行优化，以提高蔗糖的去除效果和功能性低聚糖的保留率，获得功能性成分含量及纯度均较高的大豆低聚糖产品，为大豆低聚糖生产与应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
啤酒酵母101，啤酒酵母102，啤酒酵母103，假丝酵母，茶酵母由黑龙江省微生物研究所提供；大豆糖蜜由九三集团提供。
1.2仪器与设备
LC-VP高效液相色谱仪：日本岛津；DHP-恒温培养箱：上海实验仪器厂有限公司；LPZX-50KB5立式压力蒸汽灭菌器：上海一恒科技有限公司。
1.3方法
1.3.1培养基
培养基配制：蔗糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%;干酵母活化液：葡萄糖5%，(NH4)2S04 0.2%，
K2HPO40.1%，CaSO40.1%，柠檬酸0.1%，干酵母粉9.375 g；糖蜜发酵前的处理：将糖蜜稀释一定浓度以满足不同菌的生长，pH调制几种菌的最适pH，将糖蜜稀释到50BX，pH 5.0，115℃灭菌15 min。
1.3.2色谱条件
色谱柱：Kromasil 100氨基柱250 mm×4.6 mm（大连依利特科学仪器公司）；流动相：V乙腈）：V(水）：80：20；流速：1.0 m L．min-1;检测器：示差折光检测器（RID；柱温：30 0C;检测器温度：30℃；进样量：10 μL
;天平分度值：0.000 1g；样品制备：以超纯水为溶剂配制质量浓度为5 mg．mL-1的样品，准确记录含量，过0.45μm 微孔膜。
1.3.3菌株的驯化
将活化好的菌株按4% 接种量分别接到不同比例的葡萄糖和蔗糖的培养基中，在28℃条件培养，待培养液凝固后再同一梯度传代两次。葡萄糖和蔗糖的比例分别是9:1，7:3，5：5.3：7和1：9，然后接种到下一梯度的培养基中，每次培养48 h，测活菌数和pH。使菌种适应蔗糖的生长环境，以达到驯化的目的。由于试验的最终目的是让酵母菌适应糖蜜这种高糖分的底物环境，所以需要将适应蔗糖环境的一次驯化菌进行二次驯化。按4%接种量接种到蔗糖为碳源的培养基和糖蜜（稀释17倍）不同比例混合的培养集中进行传代培养，蔗糖培养基和糖蜜的比例是3:2，2:3，1:4和1:9，由糖蜜比例低浓度到高浓度，每一梯度驯化两次，每次培养48 h，然后再接种到下一梯度，最终达到酵母菌适应糖蜜的生长环境的目的。
2结果和分析
2.1微生物发酵法精制大豆低聚糖菌株的筛选
2.1.1采用高效液相色谱对糖蜜进行检测分析
采用高效液相色谱法对大豆糖蜜的低聚糖含量进行分析，最终确定大豆糖蜜中低聚糖含量情况如表1。
由表1可以算出蔗糖、棉子糖和水苏糖占总糖含量分别是58.90%，8.15 %和31.27%。三种糖含量占总糖的98.31%，说明糖蜜中除了上述三种糖外，还有微量的其他糖分。大豆糖蜜中非功能性的蔗糖，大大降低了大豆糖蜜中低聚糖的功能性，所以去除糖蜜中的蔗糖是非常必要的。目前能有效去除大豆糖蜜中蔗糖的方法是十分困难的，蔗糖和棉子糖、水苏糖分子量差距很小，用膜分离、凝胶层析等方法很难将其分离，一些可以将其分离的方法价格昂贵，不适合工业化生产。采用了生物降解的方法，用微生物将蔗糖分解掉，避免了设备分离所带来的困难。生物降解首先要考察微生物在蔗糖下的生长情况，如果微生物生长迅速，说明该菌对蔗糖有耐受性，为进一步的大豆糖蜜发酵提供保障。
2.1.2菌种的选择
将五种酵母菌接种到大豆糖蜜中，酵母干重均随着发酵时间的延长而增长，表明酵母生长情况良好。但是单纯对酵母菌的生长情况的考察也是不全面的，应该还要对五种酵母菌对蔗糖、棉子糖和水苏糖的分解情况进行分析，筛选出一种或两种既可以在高浓度的蔗糖下生长良好，同时也要对蔗糖的降解能力强的菌，进行后续大豆糖蜜的发酵。发酵液中蔗糖、棉子糖和水苏糖的保留率见表2。
从表2可以看出，酵母菌101、假丝酵母及茶酵母易造成功能性低聚糖的损失。酵母菌102纯化大豆低聚糖的效果较好，但是所需的发酵时间较长。酵母菌103在4h时就把蔗糖全部消耗掉了，并且棉子糖和水苏糖的残糖量都相对较高，且由于大豆糖蜜中水苏糖的含量比棉子糖含量高几倍，因此水苏糖残糖量越高越好。结合以上分析，研究选择酵母菌103作为发酵法纯化大豆乳清的菌种。但是相对来说，酵母菌103有个缺点，即在没有蔗糖和其他的糖存在时，比较容易利用功能性低聚糖作为碳源。所以更需要严格控制发酵时间。
2.2单因素试验
2.2.1 发酵pH的确定
将酵母103接种于酵母种子培养基中，30 0C培养48 h，然后将种子活化液分别接种于稀释10倍不同pH的大豆糖蜜发酵液中，接种量4%，同样条件下培养然后HPLC分析糖分变化。
试验选择的pH是在3～7之间，因为酵母菌发酵糖蜜过程中偏酸性效果较好，但是pH在3以下对低聚糖的稳定性有影响了，为了保持低聚糖的稳定性，所以选择了以下的pH梯度。
由图1可知，不同pH对酵母发酵的影响较大，虽然酵母103对蔗糖的分解能力很强，但是不同pH下，水苏糖和棉子糖的保留率是不同的，培养过程中蔗糖都已经被完全分解掉，而pH 5.0时水苏糖、棉子糖的保留率相对较高，所以最适的pH为5.0。
2.2.2发酵温度的确定
配制质量分数为10%的大豆糖蜜水溶液，接入4%的液体种子，调节发酵液pH至5.0，分别在27℃，30℃．33℃．36℃和39℃下，在150 r/min恒温振荡箱中发酵48 h后，取样测定大豆低聚糖含量，计算低聚糖保存率，结果如图2所示。
由图2可知，在30℃～36℃温度范围内，糖蜜发酵液中3种糖的保存率变化不大，温度在33℃时，蔗糖被较好地利用，棉籽糖和水苏糖也有较好的保存率。因此，选择发酵温度33℃较适宜。
2.2.3发酵时间的确定
配制质量分数为10%的大豆糖蜜水溶液，接人4%的液体种子，调节发酵液pH至5.0，发酵温度28℃，在130 r/min恒温气浴振荡箱中，发酵培养不同的时间（7，9，11，13和15 h）后，取样测定大豆低聚糖含量，计算低聚糖保存率，结果如图3所示。
由图3可知，发酵时间对于蔗糖保存率呈现负相关，随着发酵时间的延长，棉籽糖和水苏糖的保存率都有所下降，造成功能性组分的损失。在发酵过程的前11 h，蔗糖得到有效的利用，表现为曲线斜率较大，发酵时间11 h后，曲线趋于平缓，说明酵母菌数量达到一定程度之后，增加速度缓慢。因此，选择最佳发酵时间为11h。
2.2.4发酵糖蜜浓度的确定
配制质量分数为2%，4%，6%，80%和10%的大豆糖蜜水溶液，接入4%的液体种子，调节发酵液的pH至5.0，发酵温度33℃，在130 r/min恒温振荡箱中发酵11 h后，取样测定大豆低聚糖含量，计算低聚糖保存率，结果如图4所示。
由图4可知，酵母对高浓度的糖蜜仍有很强的利用能力，3种糖的保存率曲线和糖蜜质量分数呈现正相关，当糖蜜质量分数为4%时，蔗糖利用率较好，棉籽糖和水苏糖的保留率较高。因此，选择最佳糖蜜质量分数为4%。
2.2.5 接种量的确定
配制质量分数为8%的大豆糖蜜水溶液，接人2%，3%，4%，5%和6%的液体种子，调节发酵液pH至5.0，发酵温度28℃，在130 r/min恒温振荡箱中发酵12 h后，取样测定大豆低聚糖含量，结果如图5所示。
从图5可知，随着接种量的增加，蔗糖在大豆低聚糖中的相对含量呈下降趋势，这对大豆低聚糖的纯化是有利的，接种量超过4%以后，棉籽糖和水苏糖的降解速率明显加快。随着接种量的增加，啤酒酵母103对低聚糖的消耗量加大，蔗糖的降解已不能满足啤酒酵母103生长的需要，此时棉籽糖和水苏糖的降解必将加快。因此，确定最佳接种量为3%。
2.3最佳工艺参数的确定
由单因素试验可以看出在发酵过程中，pH、接种量和糖液浓度对反应的影响较大，同时通过对大豆糖蜜的低聚糖含量进行分析，其中水苏糖含量相对较高。因此，确定在pH为5、接种量为3%、糖液浓度为4%的基础上采用中心组合设计(Box-Behnken)响应面分析方法，以pH (A)、接种量(B)和糖液浓度(C)为自变量，发酵液中蔗糖的保留率（R1）和水苏糖的保留率( R2)为响应值设计响应面试验。自变量水平编码表和试验设计方案及结果见表3和表4。
通过多元回归拟合，得到R1和R2对A、B、C的回归方程为：
R1=10.5 8-0.21A-2.79B+4.23C+0.28AB-0.75AC-1.85BC+4.10A2+6.70B2+8.07C2
R2=92.10+1.44A+2.35 B+0.71C+2.42AB+0.70AC+0.62BC-5.25A2-4.23B2-3.20C2
采用Design Expert 8.0.6软件对发酵后蔗糖保留率的试验结果进行方差分析，分析结果如表5所示。
由表5可知，方程因变量和自变量之间的线性关系显著，该模型回归极显( p≤0.000 1)，失拟项为0.665 2不显著(p>0.05)，且该模型R2=98.13%，
=95.73%，表明此模型与试验拟合良好，可较好地反映各因素与蔗糖保留率之间的影响关系。通过F值检验判断回归方程中各个变量的显著性情况。概率p（F>F a）值越小，说明相应变量越显著。方程中一次项C达到了极显著( p<0.001)的水平，B和C的交互作用对蔗糖保留率的影响显著(p<0.05)，A和C、A和B的交互作用对蔗糖保留率的影响不显著(p>0.05)。
根据拟合的二次多项回归方程图6分别给出了pH、接种量和糖液浓度的交互作用对蔗糖保留率的响应曲面图。
采用Design Expert 8.0.6软件对发酵后水苏糖保留率的试验结果进行方差分析，分析结果如表6所示。
由表6可知，方程因变量和自变量之间的线性关系显著，该模型回归极显( p≤0.000 1)，失拟项为0.058 5不显著(p>0.05)，且该模型R2=97.64%，
=94.60%，表明此模型与试验拟合良好，可较好地反映各因素与水苏糖保留率之间的影响关系。通过F值检验判断回归方程中各个变量的显著性情况。概率p（F>F a）值越小，说明相应变量越显著。A和B的
交互作用对水苏糖保留率的影响显著(p<0.05)，A和C、B和C的交互作用对水苏糖保留率的影响均不显著(p>0.05)。
根据拟合的二次多项回归方程，图7分别给出了pH、接种量和糖液浓度的交互作用对水苏糖保留率的响应曲面图。
利用响应面优化分析方法对回归模型进行分析，寻找最优相应，结果见表7。为检测响应面方法所得结果的可靠性，按照表中的整理值进行试验，同时对棉籽糖保留率进行测定，得到的蔗糖保留率为10.3%，水苏糖保留率为92.5%，，棉籽糖保留率为81.0%。预测值与试验值之间的良好拟合性证实了模型的有效性，表明所得出的回归方程可以很好地反应pH、接种量、糖液浓度与蔗糖保留率、水苏糖保留率的关系。
3结论
通过试验数据的比较，选择了对蔗糖有高消耗率和功能性高保留率的啤酒酵母103作为发酵菌种，通过研究酵母发酵试验中pH、温度、时间、糖蜜浓度和接种量对发酵效果的影响，最终确定的最佳发酵工艺为：pH 5.0、温度33℃、时间11 h、糖蜜浓度4%、接种量3.1%。发酵前后大豆糖蜜中的低聚糖，有着明显的变化，蔗糖去除率达到90%左右，棉籽糖和水苏糖的保存率分别为81.0%和92.5%。较发酵前功能性成分提高50%以上，大大提高了工作效率。试验通过发酵法提纯功能性低聚糖，对大豆糖蜜进行了较充分的利用，为后期的分离奠定基础。
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