带鱼蛋白亚铁螯合物的制备及性质研究

  黄赛博，林慧敏，邓尚贵

  浙江海洋学院海洋科学与技术学院（舟山316022）

  摘要带鱼蛋白亚铁螯合物的制备及性质比较。以带鱼鱼糜为原料，酶解后根据酶解液体积加入不同量的FeCl2溶液进行螯合，制备出不同比例(1%，2%，3%和4%带鱼蛋白亚铁整合物(Fe-HPH),测定螯合物的螯合率、溶解度、吸湿性和热变性温度等。2% Fe-HPH螯合率最高；1%，2%，3%和4%螯合物分别在pH为4，5，6和7时达到最大溶解度；在相对湿度为43%和81%的环境中，吸湿性均为4% Fe-HPH>3% Fe-HPH>2% Fe-HPH>1% Fe-HPH; 4种Fe-HPH热

变性温度分别为51.3℃，62.4℃，68C和73.5℃，即随着Fe2+加入量的增多而升高；紫外全波段扫描和红外光谱验证了螯合前后结构发生变化。螯合时加入Fe2+量不同，得到的螯合物性质也各有差异。

  关键词酶解；亚铁螯合；制备；性质研究

  带鱼，又名刀鱼、裙带、牙带等，在中国海域广泛分布，年捕获量丰富，是我国四大海产之一。微量元素是指在人体中所占比例小于0.01%的矿物质，包括铜、铁、锰、锌等10种元素，在机体内比重虽极小，但在维持人体健康方面作用巨大。微量元素螯合物研究始于上世纪60年代。70年代后期，最先由美国Albion实验室以动植物蛋白和铁元素为原料合成铁蛋白( Iron proteinase)的复合物，随后其生物活性也逐渐被发现。李庭以米渣为原料，酶解后与硫酸锌螯合，制备出米蛋白肽锌，它对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定抑菌作用；Fisher把与EDTA连接的酪氨酸和苯丙氨酸与二价铜离子螯合，发现其抗氧化作用达到SOD（超氧化物歧化酶）的一半；李永富等用小肽螯合铁作为补铁剂，加入饲料喂养乳猪，结果显示小肽铁比硫酸亚铁有更好的补铁效果；Found(1974)报道，复合氨基酸、多肽铁络合物是以载体形式使位于环状结构中心的铁离子得以顺利通过肠黏膜刷状缘，从而促进铁的吸收；韩希福等用蛋氨酸螯合铁、锌、锰喂猪和鸡时，糖类和蛋白质吸收利用率分别提高20%和15%。以带鱼鱼糜为原料，以亚铁为微量元素，根据Fe2+加入量的不同，研究不同比例带鱼蛋白亚铁螯合物Fe-HPH的性质差异，为微量元素螯合物作为功能食品的开发奠定理论基础。

1  材料与方法

1.1材料与试剂

  带鱼鱼糜，由浙江兴业有限公司提供。用锯子将冷冻鱼糜分装成100～200 g／袋，置于-20℃冰箱中保存。酶解前一晚移至4 ℃冷藏室中缓慢解冻。木瓜蛋白酶（Papain，酶活力20 000 IU/g），购自上海金穗生物科技有限公司；氯化亚铁（食品级）、抗坏血酸、盐酸羟胺、邻二氮菲、氢氧化钠等分析纯试剂，均购自国药集团药业股份有限公司。

1.2仪器与设备

  PHS-3C pH计，上海兰科仪器有限公司；HWS-12电热恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；SHAB恒温水浴振荡器，常州国华有限公司；FD-1000冷冻干燥机，日；N-1000旋转蒸发仪，日EYELA；电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；DSC 200 F3差式量热扫描仪，NETZSCH；LHS-250HC恒温恒湿箱，上海慧泰仪器制造有限公司；8400全自动凯式定氮仪，FOSS; U-2800紫外可见分光光度计，日日立；傅立叶红外光谱仪，美国Nicolet。

1.3试验方法

1.3.1  酶解及不同比例亚铁多肽螯合工艺

  取一定量过夜缓慢解冻好的鱼糜，料液比按照1：10( g/m L)，溶于去离子水中，用搅拌机打成匀浆。用1 mol/L HC1溶液和1 mol/L NaOH溶液将混合浆液pH调至6.5，45℃下保温10 min。根据鱼糜质量，按20 000 IU/g比例加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，在45℃下持续酶解8h。酶解完成后酶解液90℃，15min进行钝化灭酶，冷却至室温，利用抽滤和微滤去掉剩余残渣，得到淡黄色澄清酶解液，于旋转蒸发器40℃真空浓缩，冷冻干燥后即得酶解多肽，备用。

  将上述酶解液用1  mol/L NaOH溶液调pH至7.0，按体积的0.1%加入抗坏血酸，溶解后，再按酶解液体积的1%，2%，3%和4%分别加入1 mol/L FeCl2溶液，30℃震荡合成30 min，于4℃下10 000 r/min离心浓缩20 min，弃沉淀，上清液于旋转蒸发器40℃真空浓缩，冷冻干燥后即得到不同螯合比例的多肽亚铁螯合物（1%，2%，3%和4% Fe-HPH），备用。

1.3.2螯合率的测定

  标准曲线的绘制：精确称取0.497 g硫酸亚铁(FeSO4．7H2O)溶于100 m L水中，加入5 m L浓硫酸，微热，溶解后即滴加2%高锰酸钾溶液，至最后一滴红色不褪色为止。用水定容至100 m L，摇匀，得标准贮备液。此液每毫升含Fe3+100μg。取铁标准贮备液10 m L于100 m L容量瓶中，加水至刻度，混匀，得标准工作液。此液每毫升含Fe3+ 10 μg。精确吸取上述铁标准液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0mL，分别置于50 m L容量瓶中，加入1 mol/L盐酸溶液1mL、10%盐酸羟铵1 m L、0.12%邻二氮菲（现配现用）1mL，然后加入10%乙酸钠溶液5 m L，用水稀释至刻度，摇匀。以不加铁的试剂空白液作参比液，在510 nm波长处，用1 cm比色皿测光密度，绘制标准曲线。

  螯合铁源溶液浓度的确定：取1 m L Fe2+的铁源溶液稀释定容到100 m L，取1 m L按标准曲线绘制操作，定容至50 m L，测定其光密度，在标准曲线上查到相应的铁浓度C1(μg/m L)。通过换算，可求得加入铁源溶液中总的亚铁含量m1(g)。即：

  式中：V1——表示加入的总铁源溶液的体积( m L)。

  游离亚铁离子含量测定：将螯合液定容到100 m L，精确吸取5 m L螯合液定容到100 m L，取1 m L按标准曲线绘制操作，定容至50 m L，测定其光密度，在标准曲线上查得相应的铁浓度C2（μg/m L）。通过计算可求得游离亚铁离子含量为m2 (g)。即：

  式中：m1——铁源溶液中总的亚铁含量(g)；m2——游离亚铁离子含量(g)。

1.3.3溶解性测定(pH)

  通常用氮溶解指数(NSI)来评价。在室温下，分别取0.2 g螯合物粉末，溶于5 m L不同pH (3，4，5，6，7，8和9)的水溶液中，搅拌至充分溶解。溶液pH用1 mo/L HC1和NaOH预先调节好。在12 000 r/min、4℃条件下离心15 min。取上清液1 m L，稀释5倍，用双缩脲方法测上清液的蛋白含量，凯式定氮法测定样品总氮。

  氮溶解指数(NSI)=上清液含氮量／样品总氮×100%  (4）

1.3.4吸湿性测定

  将冷冻干燥的多肽粉和螯合物粉末准确称取1 g于培养皿中，置于培养箱中吸湿，控制相对湿度( RH)分别为81%和43% ，温度20℃。分别称量吸湿2，4，6，8，10，12和24 h后各试样的质量。吸湿率的计算公式：

  式中：W n——吸湿后样品质量(g)；W0——吸湿前样品质量(g)。

1.3.5差示扫描量热仪(DSC)测定 

 精确称取试样5×10 mg分别置于银质坩埚内，盖上锅盖，用密封压机密封。依次用镊子取下炉盖和两个内盖，用镊子将盛放样品的坩埚放在右侧热流传感器的中心位置，空白坩埚放在左侧热流传感器的中心位置，再依次盖上两个盖子。设置升温速率为100C/min，终止温度为120 0C，液氮为冷却介质。

1.3.6紫外全波段扫描

  称取相同质量的酶解肽粉和1%，2%，3%和4%Fe-HPH干粉，用适量去离子水溶解后进行紫外全波段扫描，扫描间距为0.1 nm，观察吸收峰。

1.3.7多肽亚铁螯合物红外光谱检测

  分别取1%，2%和3%酶解肽粉2 mg和4% Fe-HPH干粉2 mg，放入玛瑙研钵中，放入干燥的光谱纯KBr 200 mg，混合研磨均匀（在红外灯下进行），使其粒度在2.5 μm以下，装入压片模具，抽气加压，压力约为60 M Pa，维持3～5 min，卸掉压力则可得一透明KBr样品片，利用红外分光光度计进行定性分析，得到光谱。

2结果与讨论

2.1螯合率的确定

  螯合率是指微量元素与氨基酸的螯合程度。螯合率的测定在衡量产品质量、改进生产工艺、研究微量元素的作用机理等方面均有积极意义。根据酶解液体积，按照不同比例加入FeCl2溶液得到的4种螯合物螯合率各不相同。如图1所示，其中V代表FeCl2溶液的体积，V2代表酶解液的体积。螯合率高低依次为2% Fe-HPH>3% Fe-HPH>4% Fe-HPH>1% Fe-HPH，说明螯合率跟加入的Fe2+量不成比例，当加入2% FeCl2溶液时，Fe2+和氨基酸的螯合可能已达到

饱和。

2.2 Fe-HPH的溶解性

  以带鱼蛋白酶解得到的多肽粉和螯合比例为1%, 2%，3%和4% Fe-HPH粉末为样品，其溶解性随pH的变化如表1所示。

  由表1可知，pH分别为3，4和5时，4种Fe-HPH与酶解肽比溶解性差异均为极显著(p<0.01)；pH 6时，除了4% Fe-HPH与酶解肽差异极显著(p<0.01)外，其余三种无显著性差异(p<0.05)；pH 7时，与酶解肽相比，1%和3% Fe-HPH差异极显著(p<0.01)，2%Fe-HPH差异较明显(p<0.05)，而4%Fe-HPH无显著性差异(p<0.05)；pH 8时，1% Fe-HPH差异极显著(p<0.01)，2%Fe-HPH无明显差别(p<0.05)，而3%和4% Fe-HPH差异比较明显( p<0.05)；pH 9时，4种螯合物与酶解肽比均无显著性差异(p<0.05)。

  酶解肽在pH 3时有最大的溶解度71.21%，此后溶解度变小，平均在60%左右，在pH 6时，可能因为接近鱼蛋白自身酸碱值，溶解度形成一个小高峰64.52%。1%，2%，3%和4%螯合物分别在pH为4，5，6和7时有最大溶解度。在碱性pH条件下，溶解度均偏小，每组pH为9时溶解度最低。即加入Fe2+越多，Fe-HPH最大溶解度的pH越大。金属与多肽的结合，导致自身空间结构发生改变，由于金属结合量的不同，溶解性也就有所差异。

2.3  Fe-HPH的吸湿性

  酶解多肽及1%，2%，3%和4% Fe-HPH冷冻干燥后按前述方法测定其吸湿性。结果见图2和3。

  结果显示，在RH为43%和81%的条件下，5组样品的吸湿性均随时间的延长而增强，但增长速度随时间递减，12 h后趋于稳定。24 h后，5组在RH 81%时的吸湿性均比RH 43%时高。在0～2 h内，RH 81%的各组吸湿率明显高于RH 43%，但在2～12 h内，RH 81%的吸湿率要低于RH 43%。

  在RH为43%时，24 h 5组样品的吸湿性大小分别为：(5)>(4)>(3)>(2)>(1)，在RH为81%时，24 h 5组样品的吸湿性大小同样为：(5)>(4)>(3)>(2)>(1)，可见RH为43%或81%，4%的Fe-HPH的吸湿性均最高。

2．4  Fe-HPH的热变性温度

  差式扫描量热法是在温度程序控制下，测量输送给被测物质和参比物质的能量差值与温度之间的关系的一组技术，大多数物质随着温度的变化，结构将发生变化，同时伴随能量的改变。热变性曲线的最大迁移点（吸热峰）即样品的热变性温度。酶解肽和17~4% Fe-HPH的热迁移曲线如图4所示。图4中的曲线由下到上依次为酶解肽（未螯合），1%，2%，3%和4% Fe-HPH。

  由图可知，其变性温度分别为47.5℃，51.3℃，62.4℃，68℃和73.5℃，表明Fe2+的加入会改变原呔的热变性温度，且加入的Fe2+越多，其变性温度越高二可能由于肽与Fe2+结合后，生成络合物，结构发生变化，从而改变了热变性温度。

2.5  Fe-HPH紫外全波段扫描分析

  紫外扫描结果如图5所示，其中a为多肽扫描图，b、c、d、e分别为1%，2%，3%和4% Fe-HPH扫描图。由图可知，多肽和螯合物的紫外扫描吸收峰数目相同，都是2个峰，但吸收波长和峰值存在明显差异。a图中，两个峰的吸收波长为202和279 nm，前者的峰值显著高于后者；b图中，两个峰的波长为204和255 nm；c图中，两个峰波长是203和263 nm；d图为208和257 nm；e图为205和250 nm，b、c、d和e中两峰的峰值都是后者高于前者，恰与a相反。而200～220nm是因肽键存在引起的吸收峰，250～280 nm是部分氨基酸残基引起的吸收峰，说明多肽与亚铁螯合后，吸收峰发生推移，氨基酸残基的特征吸收峰值减弱，肽键特征吸收峰峰值加强，可以推测Fe2+可能与氨基酸结合生成类似于肽键的结构。

2.6 Fe-HPH的红外图谱分析

  图5是用溴化钾压片法测定带鱼酶解肽及Fe-HPH在波数400～4 000 cm-l范围的红外光谱图，自上而下分别为酶解肽、1%、2%、3%和4% Fe-HPH。由图可知，整个波数范围内主要出现4个波峰。属于多肽红外光谱的酰胺A谱带位于3 415.27 cm-l处，主要由NH的伸缩振动所致；1 647.65 cm-1处的吸收峰属于酰胺I带，由C=O伸缩振动引起；1 407.35 cm-1属于多肽氨基酸残基的侧链基团；1 046.17 cm-1属于铵盐NH4+的特征吸收峰。对比带鱼多肽红外光谱图发现加入了Fe2+后，氨基的伸缩吸收峰由3 415.27 cm-1分别往高波段移到3 420.48,3 423.03，3 423.16和3 426.72 cm-1处，吸收峰比多肽更强；酰胺I带则向低波段方向发生移动，变成1646.02，11643.44，1 641.35和1 640.32 cm-1；铵盐NH4+的特征吸收峰向高波段移了四五个波数，且峰值加强。酰胺A向高波数方向移动，酰胺I带向低波数方向移动，铵盐NH4+的特征吸收峰加强，充分说明多肽的氨基和羧基可能都参与了与Fe2+的配位，而不同比例Fe-HPH的吸收峰基本一致，说明Fe2+加入量的高低不会影响Fe-HPH的结构。

3结论

  利用带鱼鱼糜和FeCl2溶液制备出4种不同比例的Fe-HPH，其性质存在差异。2% Fe-HPH螯合率最高，说明螯合率的高低与Fe2+的加入量不成正比；多肽在pH 3时溶解性最好，1%，2%，3%和4% Fe-HPH分别在pH 4，5，6和7时达到最大溶解度，推断随着Fe2+螯合量增多，最大溶解度所处的pH将越大；在RH 43%和81%的条件下，24 h吸湿后吸湿性的高低均是4% Fe-HPH>3% Fe-HPH>2% Fe-HPH>1% Fe-HPH>多肽；多肽的热变性温度属于正常蛋白质变性温度范围内，而4种Fe-HPH的热性变温度均高于多肽，推测加入Fe2+越多，铁含量越高，变性温度将越高。螯合饱和后剩余的Fe2+可能以FeCl2的形式继续存在，因此也影响着螯合物的铁含量；紫外全波段扫描中，多肽螯合亚铁前后，氨基酸残基吸收峰由强变弱，肽键吸收峰由若变强，推测Fe2+可能与氨基酸结合生成类似于肽键的结构；红外光谱中，推测F e2+与氨基、羧基发生结合。今后可以对Fe-HPH进一步分离纯化，研究其更多的生物活性，并对多肽和亚铁螯合机理做进一步研究。