范萌萌1．蒋爱民1*，张献伟1,2，麦盛昕1，黄小峰1，陈贤1
1．华南农业大学食品学院（广州510642）：2．惠州市海洋与渔业局(惠州516001)
摘要研究了不同碱处理对蛋清蛋黄碱诱导凝胶水分的影响，采用低场核磁共振技术测定凝胶中水分变化。结
果表明，0．60%和0．7%NaOH处理组蛋清凝胶的T弛豫时间图上仅有2个峰，说明在凝胶体系中，存在2种水相状态：结合水和不易流动水。0.7% NaOH处理组蛋清凝胶不易流动水T22为83.75±1.22 ms,显著高于0.6% NaOH处理组蛋清凝胶不易流动水T2276.65±1.25 ms (p<0．05)；1.0%和1.2%NaOH处理组蛋黄凝胶的T2弛豫时间图上有3个峰，说明在凝胶体系中存在3种水相状态：结合水、不易流动水和自由水。T21从0.46±0.02 ms增加到0.69±0.03rris; T22从29.62±0．86 ms增加到36.80±0．53 ms; T23从198.45±4.94 ms增加到370.19±10.29 ms。说明T2可以反映蛋清和蛋黄碱诱导凝胶的水分状态和组成。
关键词低场核磁共振：横向弛豫时间；水分测定；蛋清蛋黄碱诱导凝胶
皮蛋是一种主要由碱腌制而成的蛋制品，加工历史悠久，是我国独创的传统蛋制品。近十几年来，国内学者对皮蛋加工工艺、无铅化技术进行了大量的研究，毫无疑问，这些努力对促进皮蛋的科学生产起到了重要作用。皮蛋中的水分含量和状态变化对皮蛋的品质有着重要影响，通过烘干法测定的水分含量为蛋白凝胶中自由水与不易流动水的总含量。目前，低场核磁共振技术大多用在肉及肉制品的保水性和水分含量等方面，在地沟油的鉴定和方便米饭品质的鉴定等食品检测上也广泛应用，但是在蛋及蛋制品上的应用较少。
报道H质子共振频率小于100 MHz的NMR，称为低场核磁共振(Low field-NMR)。LF-
NMR作为一种快速无损的检测技术，可以观察水分中H质子的流动和分布，得到样品中水的动态变化情况。目前，LF-NMR用于食品中水分研究主要采用自旋一自旋弛豫（横向弛豫）时间T2，是由于T2对水分多相态的存在更加敏感，通过分析T2弛豫时间的不同，较容易区分出不与固体颗粒或溶质分子相互作用的易流动损失的自由水分和通过物理、化学作用紧密
结合的水分或不易移动水分。T2反映了样品内部氢质子所处的化学环境，与氢质子所受的束缚力及其自由度有关，而氢质子的束缚程度又与样品的内部结构有密不可分的关系。氢质子受束缚越大或自由度越小，T2弛豫时间越短，在T2谱上峰位置较靠左；反之则T2弛豫时间越长，在T2谱上峰位置较靠右。试验通过LF-NMR测定弛豫时间T2，观察在不同碱处理下蛋清与蛋黄碱诱导凝胶的水分分布状态变化。
1 材料与方法
1.1原料
鸭蛋：华南农业大学三角市；食用级NaOH:滨化集团股份有限公司；茶多酚：浙江大学茶学系。
1.2主要仪器与设备
NMR PQO01分析仪：上海纽迈电子科技有限公司；HM-945多功能搅拌器：广州东菱有限公司。
1.3试验方法
蛋清和蛋黄碱诱导凝胶的制备：取新鲜鸭蛋数枚，用75%乙醇擦拭鸭蛋表面，保证其清洁、完整无损。破壳后去除系带，分离蛋清与蛋黄，使用多功能搅拌器(1 000 r/min)分别搅拌1 min，静置2 h，冷藏备用。将洗净后的100 m L烧杯，置于121 0C高压蒸汽灭菌锅内，杀菌20～30 min。先将经前处理的新鲜鸭蛋清和蛋黄倒入已灭菌的容器中，添加配好的腌制液，搅拌均匀后用保鲜膜密封，放到数显恒温恒湿箱中25 0C下蛋清碱诱导凝胶熟成24 h，蛋黄碱诱导凝胶熟成7 d。测试驰豫时间T2，研究不同碱处理对蛋清与蛋黄碱诱导凝胶加工过程中水分的变化。
参照Goetz等的方法并略有修改，测试条件为：质子共振频率为21.6 MHZ，测量温
度为室温( 30.00℃±0.01℃ )。将样品切成1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的长方体，放入离心管中再放人直径15 mm的核磁管，进行测试。自旋-自旋弛豫时间T2用CPMG( Carr-Purcell-Mebiboom-Gill)序列进行测量。设置参数为：T-值（900脉冲和1800脉冲之间的时间）为300μs，重复扫描32次，重复间隔时间为6 500 ms得到16 000个回波，得到的图为指数衰减图形，每个测试有四个重复。NMR弛豫测量得到的图为指数衰减曲线，其数学模型为：
式中：A(t)-------衰减到时间t时的幅值大小；t--------衰减时间；A0一平衡时的幅值大小；
一第i个组分平衡时的幅值大小；T2i一第i组分的自旋一自旋弛豫时间。
用仪器配套的Multi Ex PInv Analysis软件进行反演CMPG指数衰减曲线，得到样品的T2值。该软件使用整体迭代修正的NMR弛豫信号多指数反演算法。
2结果与讨论
2.1不同浓度碱处理对蛋清碱诱导凝胶T2的影响
图1显示不同碱处理对蛋清碱诱导凝胶T2弛豫时间的影响。由于0.6%和0.7%NaOH处理组蛋清凝胶表现出较强的凝胶特性，利用LF-NMR检测了凝胶样品的T2弛豫时间的分布，同时以新鲜蛋清的T2弛豫时间分布为空白对照。结果表明，不同碱处理对蛋清凝胶T2弛豫时间分布具有显著的影响(p<0.05)。由图1可知，对CPMG脉冲序列得到的衰减曲线进行多指数拟合后，发现T2在0.1～10 000 ms的弛豫时间分布上出现了3种峰，这与用LF-NMR测量乳清蛋白与卵白蛋白中得到的结果相类似。从图1分析得出，这3种峰对应时间为T21: 1.84—15.15 ms;T22：45.36 m—114.19ms；T23: 256.17—483.29 ms，可能分别对应于样品中水分的三种状态结合水T21( Immobile phase)、不易移动水T22( Mobile phase)和自由水T23( Very mobilephase)。
新鲜蛋清的NMRT2弛豫时间图上有2个峰，表明体系中存在2种水相状态（结合水和自由水），其中结合水T21存在2个弛豫时间，分别为6.61±0.10 ms和8.63±0.14 ms，所占峰面积比例为6.83%±0.25%；自由水T23弛豫时间为364.81±5.30 ms，所占峰面积比例为93.17%±0.25%．表明新鲜蛋清中结合水比例很小，自由水比例占绝大多数，而不易流动水所占比例极小，未检测出来。0.6%和0.7% NaOH处理组蛋清凝胶的T2弛豫时间图上仅有2个峰，说明在凝胶体系中，存在2种水相状态：结合水和不易流动水，其中不易移动水占绝大部分，未检测出自由水，这可能由于蛋清在强碱NaOH的作用下，蛋白质分子发生变性，经分子间和分子内相互作用交联凝聚，反应过程中再与体系中的水通过物理化学键合而形成凝胶三维空间网络结构，而且体系中的自由水吸附填充在凝胶网络结构中，“态变”水为不易流动水，结果表明碱处理可显著改变蛋清体系中水相的分布，诱导蛋清蛋白质发生变性并通过水合作用形成凝胶。0.7% NaOH处理组蛋清凝胶结合水T21弛豫时间为4.30±0.26 ms，显著低于0.6% NaOH处理组蛋清凝胶结合水T21弛豫时间6.46±0.26 ms( p< 0.05)，表明不同碱处理可显著影响凝胶体系中蛋白质分子与水的键合力，其中蛋清经0.7% NaOH处理后，变性的蛋白质分子与体系中的水化学键合力强，水中的氢质子受束缚较大，从而增强蛋清凝胶的网络结构，表现出较强的凝胶特性。此外，0.7% NaOH处理组蛋清凝胶不易流动水T22为83.75±1.22 ms，显著高于0.6% NaOH处理组蛋清凝胶不易流动水T，76.65±1.25 ms和所占峰面积比例97.53%±0.20%( p< 0.05)。蛋清凝胶的T22弛豫时间和所占峰面积比例随着NaOH含量增加而显著升高，说明体系中较多的水分填充在凝胶网络结构中，且这部分水的流动性增大，使蛋清凝胶具有较高的弹性和回复性，表现出较好的凝胶特性。
2.2不同碱处理对蛋黄碱诱导凝胶低场NMRT弛豫时间的影响
图2显示不同碱处理对蛋黄碱诱导凝胶T2弛豫时间的影响。结果表明，不同碱处理对蛋黄凝胶T2分布具有显著的影响(P<0.05)。由图2可知，对CPMG脉冲序列得到的衰减曲线进行多指数拟合后，发现T2在0.1—10 000 ms的弛豫时间分布上出现了3种峰，这与用LF-NMR测量蛋清碱诱导凝胶得到的结果相类似（图1）。从图2分析得出，这3种峰对应时间为T21: 0～2.32 ms；T22: 8.76～60.53 ms; T23:62.30～203.36 ms．可能分别对应于样品中水分的三种状态结合水T21( Immobile phase)、不易移动水T22( Mobile phase)和自由水T23(Very mobile phase)。
新鲜蛋黄的NMRT弛豫时间图上有3个峰，表明体系中存在3种水相状态（结合水、不易移动水和自由水），其中结合水T21弛豫时间为0.99±0.02 ms，所占峰面积比例为6.40%±0.22%；不易移动水T22弛豫时间为20.37±0.30 ms，所占峰面积比例为80.11%±0.26%；自由水T23弛豫时间为118.40±1.72 ms，所占峰面积比例为13.42%±0.30%，表明新鲜蛋黄中结合水比例最小，自由水比例次之，不易流动水比例占绝大多数，这可能是因为蛋黄中蛋白质具有很好的乳化作用，能把脂肪分散成很小的油滴，水分包裹这层小油滴被蛋白质所束缚，弛豫时间减小，水分流动性减弱。1.0%和1.2% NaOH处理组蛋黄凝胶的T弛豫时间图
上有3个峰，说明在凝胶体系中存在3种水相状态：结合水、不易流动水和自由水。随着NaOH含量的增加，第一个峰值T21变化不大(P>0.05)，T22和T23都显著增加(p<0.05)。T21从0.46±0.02 ms增加到0.69±0.03 ms，所占峰面积比例从1.51%±0.09%增加到2.61%±0.20%；T22从29.62±0.86 ms增加到36.80±0.53 ms，所占峰面积比例从96.14%±0.15%减少到95.90%±0.20%; T23从198.45±4.94 ms增加到370.19±10.29 ms．所占峰面积比例从2.34%±0.08%
减少到1.49%±0.04%。
由图2可知，当新鲜蛋黄经碱处理后，蛋白质变性而形成凝胶，其结合水峰往左偏移，驰豫时间减小，表明体系中的结合水相键合力更强，水中的氢质子自由度小，受束缚较大，但所占峰面积比例显著下降(p<0.05)；其不易移动水峰和自由水峰均向右偏移，驰豫时间增大，表明体系中的不易流动水和自由水的流动性增强，并且不易流动水所占峰面积比例显著升高(p<0.05)，同时自由水所占峰面积比例显著降低(p<0.05)，表明蛋黄在碱诱导凝胶过程中，
变性蛋白质分子通过水合作用交联吸附体系中的水填充在三维凝胶网络结构中，使较多的自由水转变成不易流动水。随着处理组NaOH含量的提高，蛋黄凝胶的结合水峰、不易流动水峰和自由水峰均向右偏移，驰豫时间增大，表明凝胶体系水中的氢质子自由度较大，受束缚较小。其中，不易流动水所占峰面积比例无显著差异(p>0.05)，自由水所占峰面积比例明显
降低(p<0.05)，结合水所占峰面积比例显著升高(p<0.05)，表明1.2%NaOH处理组蛋黄凝胶形成过程中更多的自由水通过水合作用与变性的蛋白质分子交联，并填充在凝胶网络结构中转变为结合水，增强蛋黄凝胶体系的品质特性。
3结论
蛋白凝胶中的结合水是与蛋白质大分子紧密结合或参与大分子组成的那部分水，烘干法无法除去这部分水。因此，通过烘干法测定的水分含量为蛋白凝胶中自由水与不易流动水的总含量。通过试验发现，T2可以反映蛋清和蛋黄碱诱导凝胶的水分状态和组成，再结合低场核磁共振成像技术测定蛋白凝胶的质子密度就可以反映蛋白凝胶的水分分布，从而综合分析肌原纤维蛋白凝胶保水性和凝胶中的水分组成、分布及含量。同时与传统干燥法的测定结果进行对比分析，发现低场核磁共振技术与传统技术的测定结果高度吻合。
综上所述，低场核磁共振技术可以方便、快捷、准确、无损地测定蛋清和蛋黄碱诱导凝胶的保水性，水分组成、分布及含量。因此，试验为低场核磁共振技术在蛋白凝胶及凝胶类制品中的应用提供了理论依据。应用LF-NMR检测分析蛋清蛋黄碱诱导凝胶的水分分布状态、流动性及其与相关食用品质、特性间的相关性等，从而快速、动态地预测和控制鸭蛋制品的质量已经具有一定的技术可行性。
