一种超声协同微波辅助提取稻壳绿原酸的新工艺

作者张毅           

    近年来，超声波和微波技术在植物有效成分的提取方面得到了广泛的应用。超声波是一种高频机械波，具有较强的机械物理粉碎和空化作用，其作用可以提高产品的得率。微波温度升高速度快，热效率高，能够将能量快速传递和充分利用，加速细胞内有效成分的快速溶出。

  以稻壳为原料，乙醇为浸提剂，采用超声波协同微波提取绿原酸，在单因素试验的基础上采用中心组合设计对工艺条件进行优化，目的探求稻壳绿原酸提取的最佳工艺条件，同时为稻壳的进一步开发提供理论依据。

1  材料与方法

1.1材料与仪器

  稻壳，绥化市农田采集，自然晾干，粉碎，过80目筛；绿原酸标准品：北京中科三捷生物有限公司；无水乙醇，为分析纯。

  TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-200VDE型双频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D循环水式真空泵：郑州长城科工贸有限公司；美的家用微波炉：佛山顺德美的微波电器制造有限公司。

1.2试验方法

1.2.1绿原酸标准品最大吸收波长的选择及标准曲线的制作

  精确称取绿原酸标准品0.005 0 g，用体积分数60%乙醇溶解，定容至100 m L容量瓶中，摇匀得浓度为0.050 mg/m L的绿原酸标准溶液。取适量绿原酸标准液于200～450 nm波长范围内进行扫描，以60%乙醇空白为对照，选取绿原酸最大吸光度波长。

  精密吸取绿原酸标准液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 m L，分别置于10 m L容量瓶中，加60%乙醇定容，摇匀。以60%乙醇为空白，在绿原酸最大吸收波长327 nm条件下测定吸光度，以绿原酸标准样品质量浓度（X，mg/L）为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得标准回归方程。

1.2.2绿原酸含量的测定

  取不同提取方法所得样品液0,2 m L，于10 m L刻度试管中，定容至4 m L，按标准曲线步骤进行，于波长327 nm处比色测其吸光值，以60%乙醇溶液为空白参比，然后根据线性回归方程计算出每毫升提取液中的绿原酸量，再根据式(1)计算总绿原酸的提取量。

  式中：C----依据标准曲线计算出测定样液的质量浓度，mg/m L; V2——测定吸光度时样液的定容体积，m L; V1-----提取液总体积，m L; V0----测定吸光度移取样液的体积，m L；W-----样品质量，g。

1.2.3微波辅助超声波提取工艺

  称取3g稻壳，用6 m L水润湿，在微波功率800 W的条件下微波一定时间后，取出晾凉，加入蒸馏水和无水乙醇使浸提溶液为一定体积分数的乙醇溶液，再在一定的超声功率、超声温度下提取一定时间后，抽滤，蒸发浓缩，定容至25 m L，按1.2.2的方法测定绿原酸含量。

1.2.4单因素试验

1.2.4.1微波作用时间对绿原酸提取量的影响

  浸提剂乙醇体积分数60%，料液比1：20(g／mL)，超声功率200 W，超声温度50℃，超声作用时间20 min，考察微波作用时间对稻壳绿原酸提取量的影响。

1.2.4.2超声作用功率对绿原酸提取量的影响

  浸提剂乙醇体积分数60%，料液比1：20(g／mL)，微波作用时间30 s，超声作用温度50℃，超声时间20 min，考察超声作用功率对稻壳绿原酸提取量的影响。

1.2.4.3超声作用温度对绿原酸提取量的影响

  浸提剂乙醇体积分数60 %，料液比1：20(g／mL)，微波作用时间30 s，超声功率160 W，超声作用时间20 min，考察超声作用温度对稻壳绿原酸提取量的影响。

1.2.4.4浸提剂乙醇体积分数对绿原酸提取量的影响

  料液比1：20( g/m L)，微波作用时间30 s，超声功率160 W，超声作用温度80℃，超声作用时间20 min，考察乙醇体积分数对稻壳绿原酸提取量的影响。

1.2.4.5料液比对绿原酸提取量的影响

  浸提剂乙醇体积分数50%，微波作用时间30 s，超声功率160 W，超声作用温度80℃，超声作用时间20 min，考察料液比对稻壳绿原酸提取量的影响。

1.2.5  中心组合设计试验

  根据中心组合试验设计原理，结合单因素试验的影响结果，以微波时间（X1）、乙醇体积分数（X2）和料液比（X3）3个因素为自变量，以稻壳绿原酸提取量为考察值，试验因素与水平见表1。

2结果与分析

2.1最大吸收波长及标准曲线的绘制

  以绿原酸吸收波长为横坐标，以不同波长下的吸光度为纵坐标，扫描得绿原酸标准品的吸收波长光谱见图1。以绿原酸标准品质量浓度(X，mg/L)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线见图2，并且得标准回归方程Y=0.055 6X-0.013 4，相关系数R2=0.999 6。

  图1看出，绿原酸在327nm处有最大吸收峰，因此最大吸收波长选择327 nm。图2看出，绿原酸浓度在5～25 mg/L的范围内呈良好的线性相关性。

2.2单因素试验分析

2.2.1微波作用时间对绿原酸提取量的影响

  不同的微波作用时间对绿原酸提取量的影响结果见图3。

由图3看出，绿原酸提取量随着微波作用时间的增长而升高，微波作用30 s时效果较好，这是因为随着微波作用时间的增长，体系温度会不断升高，稻壳细胞更易破裂，并打通了溶剂进入细胞内的通道从而有利于绿原酸的浸出。当微波作用时间超过30 s，提取量反而有下降的趋势，可能是因为微波作用时间过长破坏了绿原酸的分子结构，从而导致提取量下降。因此确定提取绿原酸的最佳微波作用时间为30 s。

2.2.2超声作用功率对绿原酸提取量的影响

  不同的超声功率对绿原酸提取量的影响结果见图4。

  由图4看出，绿原酸提取量随超声功率的升高而升高，超声功率为160 W时效果较好，这是因为随着超声功率的升高，稻壳细胞破坏程度增大，从而有利于绿原酸的浸出。当超声功率超过160 W，提取量反而有下降的趋势，可能是因为超声功率过高会破坏绿泵酸的邻二酚羟基的结构，从而导致提取量下降。因此确定提取绿原酸的最佳超声功率为160 W。

1.2.3超声作用温度对绿原酸提取量的影响

  不同的超声作用温度对绿原酸提取量的影响结果见图5。

  由图5看出，绿原酸提取量随超声作用温度的升高而升高，超声作用温度80℃时效果较好，这是因为随着温度的升高，溶剂分子和溶质分子运动加剧促进了扩散作用，从而有利于绿原酸的浸出。当超声温度超过80℃，提取量反而有下降的趋势，可能是因为超声温度过高使绿原酸发生了变性，从而导致提取量下降二因此确定提取绿原酸的最佳超声温度为80℃。

2.2.4乙醇体积分数对绿原酸提取量的影响

  不同的乙醇体积分数对绿原酸提取量的影响结果见图6。

  由图6可以看出，绿原酸提取量随乙醇体积分数的升高而升高，乙醇体积分数为50%时效果较好，这是因为绿原酸易溶于乙醇，乙醇体积分数越高，越有利于绿原酸的溶解。当乙醇体积分数超过50%，提取量反而有下降的趋势，可能是因为乙醇体积分数过高会将一些非绿原酸物质溶出，进而使绿原酸的浸出量减少，从而导致提取量下降。因此确定提取绿原酸的最佳乙醇体积分数为50%。

2.2.5料液比对绿原酸提取量的影响

料液比对绿原酸提取量的影响结果见图7。

  由图7看出，绿原酸提取量随料液比的升高而升高，料液比1：20( g/m L)时效果较好，这是因为随着料液比的升高，溶剂分子能溶解更多的溶质分子，从而有利于绿原酸的浸出。当料液比超过1：20(g／m L)时，提取率基本趋于稳定，但是从节约能源的角度考虑，认为料液比为1：20( g/m L)时最为合适。因此确定提取绿原酸的最佳料液比为1：20(g／m L)。

2.3  响应面优化试验分析

  利用中心组合试验设计，确定3因素3水平，共17个试验。其中14个析因点，3个0点。中心点重复试验用来估计试验误差，以稻壳绿原酸提取量为考察值做中心组合试验，试验结果见表2。

  采用Design-Expert 7.0软件对响应值与各因素进行多元回归拟合，得到以稻壳绿原酸提取量为目标函数的二次回归方程：

  回归模型的方差结果（表3）表明，微波时间、乙醇体积分数和料液比对绿原酸提取量的影响极显著(p<0.01)，微波时间与料液比，乙醇体积分数与料液比的交互作用达到显著水平(p<0.05)，说明它们的交互作用对稻壳绿原酸提取量有显著影响（见图8）。回归模型达到极显著水平，说明该方程能准确反映绿原酸提取量与各因素之间的关系。失拟项p=0.447 4>0.05，不显著，说明方程对试验拟合良好，试验误差小。相关系数R2=0.986 9，表明有98.69%的数据可以用此回归模型来解释。

  最终由回归方程得出最高指标时各个因素组合：Y=3.959 41,X1=33.85,X2=51.97,X3=22.25，即微波时间33.85 s、乙醇体积分数51.97%，料液比1：22.25( g/m L)，在此条件下稻壳绿原酸的提取量为3.96mg/g。

  为检验预测结果的可靠性，采用最优提取条件进行稻壳绿原酸的提取，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为微波时间34 s，乙醇体积分数52%，料液比1：22( g/m L)，3次平行试验得到的实际提取量为3.94 mg/g，与最优理论值相近，说明响应面优化的提取工艺参数准确可靠，具有可行性。

3结论

稻壳中富含绿原酸，通过单因素试验和中心组合试验以及响应面优化分析得出超声波辅助微波提取绿原酸的最佳工艺为：微波时间34 s，乙醇体积分数52%，料液比1：22( g/m L)，超声功率160 W，超声温度80℃，超声时间20 min，在此条件下稻壳绿原酸提取量为3.94 mg/g。

4摘要  以乙醇为提取溶剂，对稻壳绿原酸进行超声协同微波提取研究。在单因素试验的基础上，以微波时间、乙醇体积分数和料液比为自变量，绿原酸提取量为响应值，研究各自变量交互作用及其对绿原酸提取量的影响。结果表明，稻壳绿原酸提取的最佳工艺条件：微波时间34 s，乙醇体积分数52%，料液比1：22 (g/m L)，超声功率160 W，超声温度80℃，超声时间20 min，在此条件下稻壳绿原酸提取量为3.94 mg/g。