关于 酶一酸水解法制备水溶性珍珠粉的探索

作者：张毅

  水溶性珍珠粉一般是使用酸或者酶对珍珠粉进行处理，将其不溶成分碳酸钙和角质蛋白变成可溶于水且90%以上能被人体直接吸收利用的活性钙、游离氨基酸和微量元素。水溶性珍珠粉因其大部分营养成分都能被人体直接吸收，多用于内服治疗保健，通过调节人体内分泌，促进新陈代谢和增强机体免疫力，预防心血管疾病，改善心脏功能以及抑制癌细胞增生等。有关水溶性珍珠粉的合适加工工艺、分子质量分布以及抗氧化活性鲜见文献报道。试验对水溶性珍珠粉加工的主要工艺参数优化，且测定其产物分子质量分布和清除超氧阴离子自由基能力，为定向制备功能性珍珠肽产品以及抗氧化活性研究提供有益的参考和借鉴。

1  材料与方法

1.1材料与试剂

  珍珠粉：湖南今珠生物有限公司提供；中性蛋白酶（酶活力10万U/g）：广西庞博生物工程有限公司。

1.2仪器与设备

  Waters 600高效液相色谱仪：美国沃特斯公司；UVmini-1240紫外可见分光光度计：岛津制作所。

1.3主要试验流程

  称取1.5 g珍珠粉放人锥形瓶一加蒸馏水至30mL->煮沸->降温->加入->定量中性蛋白酶->反应->段时间->加入->定量中性蛋白酶->反应->段时间->升温至90℃加入->定量乳酸煮沸->保温2 h (95℃—100℃)

1.4工艺参数优化单因素试验设计

1.4.1  乳酸用量对珍珠粉水解度的影响

  乳酸用量分别为：1.5，2，2.5，3和3.5 L。

  取5个锥形瓶（分别标记1，2，3，4和5）->1.5g珍珠粉加蒸馏水至30 m L->降温至37℃，加入0.2 g中性蛋白酶斗反应3 h，加入0.1 g中性蛋白酶->反应3h，升温至90℃->分别加1.5，2，2.5，3和3.5 L乳酸->煮沸，保温2 h

1.4.2加酶量（分2次添加）对珍珠粉水解度的影响

  第一次加酶量：0.14，0.17，0.20，0.23和0.26g；第二次加酶量：0.04，0.07，0.10，0.13和0.16 g。

  取5个锥形瓶（分别标记1，2，3，4和5）-y1.5 g珍珠粉加蒸馏水至30 m L->降温至37℃，分别加中性蛋白酶0.14，0.17，0.20，0.23和0.26->反应3h，分别加中性蛋白酶0.04，0.07，0.10，0.13和0.16 g-反应3h，升温至90℃->加3 m L乳酸->煮沸，保温2 h

1.4.3酶解时间对珍珠粉水解度的影响

  第一次酶解时间：140，160，180，200和220min；第二次酶解时间：140，160，180，200和220min。

  取5个锥形瓶（分别标记1，2，3，4和5）-+1.5 g珍珠粉加蒸馏水至30 m L降温至37℃，加0.23 g中性蛋白酶->分别反应140，160，180，200和220 min->加0.13 g中性蛋白酶->分别反应140，160，180，200和220 min-升温至90℃->加3 m L乳酸->煮沸，保温2 h

1.4.4酶解温度对珍珠粉水解度的影响

  温度设置：30℃，35℃，40℃，45℃和50℃。

  取5个锥形瓶（分别标记1，2，3，4和5）->1.5 g珍珠粉加蒸馏水至30 m L->分别控温至30℃，35℃，40℃，45℃ 和50℃->加0.23 g中性蛋白酶->反应200min->加0.13 g中性蛋白酶->反应200 min，升温至90℃->加3mL乳酸->煮沸，保温2h

1.5珍珠水解液pH的测定

  用pH测试仪测定珍珠水解液pH，确保珍珠粉在适宜的酸度环境下正常酸解。

1.6游离氨基氮的测定

  样品滤液2 m L于锥形瓶中->蒸馏水4 m L->3滴酚酞指示剂，摇匀->氢氧化钠溶液滴定至微红色->中性甲醛溶液2 m L，摇匀，放置片刻->0.003 75 mol/L氢氧化钠溶液滴定至微红色终点

  氨基氮含量的计算如公式(1)所示。

  式中：V1-------样品加甲醛后消耗的氢氧化钠体积，m L; V2——空白加甲醛后消耗的氢氧化钠体积，M L; c-------氢氧化钠浓度，mol/L; m-------样品质量，g。

1.7分子质量分布的测定

  取水解前后的珍珠粉样品进行分子质量分布测定。样品制备：样品溶解于流动相，高速离心(8 000r/min，10 min)，用0.45 um微孔滤膜过滤后供进样。液相色谱条件：色谱柱UltrahydrogelrM Linear 300mm×7.8 mm；流动相0.1 mol/L NaNO3；流速0.9 m L/min；柱温45℃；分子质量校正曲线所用标准品：MW2000000、MW133 800、MW7100、MW2500和

MW180。分子质量计算如公式(2)。

  式中：Mw——分子质量，D a；T-洗脱时间，min。

1.8清除超氧阴离子自由基能力测定

  取酸酶水解前后的珍珠粉样品测定其清除超氧阴离子自由基，测定方法参考文献。

取4.5 m L 0.05 mol/L Tris缓冲溶液(pH 8.2)于试管中一加待测溶液1.0 m L->加蒸馏水3.0 m L->混匀，放入25℃水浴锅中保温20 min->取出后立即加入25℃水浴过的0.05 mol邻苯三酚0.5 m L->混匀后立即倒人比色皿中->于420 nm处每隔30 s测值一次，共测5 min

自由基清除率的计算方法如公式(3)。

  式中：F r——对照溶液吸光度随时间的变化率，%；F x——待测样品吸光度随时间的变化率，%。

2结果与讨论

2.1  乳酸用量对珍珠粉水解度的影响

  乳酸用量对珍珠粉水解度的影响如表1所示。随着乳酸用量的增加，氨基酸氮的含量逐渐增加，当乳酸用量为3 m L，珍珠粉水解最充分，氨基氮含量最高。原因可能是乳酸用量较少，无法对酶解后游离的蛋白质进一步充分酸解，那么溶液中分子质量较小的水溶性蛋白质、多肽、氨基酸等的含量也相应减少，从而影响氨基氮的含量。

  比较研究了水溶性珍珠粉不同制备工艺，结果表明酶酸水解法相比酸酶水解法和乳酸水解法对珍珠粉的水解更加充分，1g珍珠粉的乳酸用量为2.15 m L．而试验1.5 g珍珠粉乳酸用量为3 m L，水解珍珠粉的乳酸用量基本上一致。

2.2加酶量对珍珠粉水解度的影响

  加酶量对珍珠粉水解度的影响结果如表2所示。2次加酶量分别为0.23 g，0.13 g，珍珠粉水解最充分，氨基氮含量最高，且测定水解液pH 5.3，处于正常pH5~6之内，对珍珠液的酶解没有明显的影响。分析比较水平4和水平5，加酶量不同，但其氨基氮含量差异非常小，其原因是加酶量达到最佳值，水解完全，如果酶的用量过大，一方面不经济，另一方面也给后续处理带来不便。制备淡水珍珠水解液用胰蛋白酶，而试验用中性蛋白酶，这也导致酶的用量存在差异。

2.3酶解时间对珍珠粉水解度的影响

  酶解时间对珍珠粉水解度的影响如表3所示，反应200 min，珍珠粉的水解最充分，氨基氮含量最高。推测原因可能是如果酶解时间不充足，珍珠粉中的角蛋白和碳酸钙等水解不充分，从而影响最终氨基氮的含量。

  用正交试验法摸索水解珍珠的最佳工艺，研究表明最佳水解时间为24 h。可能是因为其水

解珍珠的制备工艺是酸水解法，而试验用的是酶酸水解法。淡水珍珠水解液的制备的最佳水解时间为6h，而试验最佳水解时间为6 h 40 min，水解时间存在一致性。

2.4酶解温度对珍珠粉水解度的影响

  酶解温度对珍珠粉水解度的影响如表4所示，反应温度40℃，珍珠液水解最充分，氨基氮含量最高。试验中，酶解温度40℃，条件温和，不会引起蛋白质变性损失，而物理研磨处理过程中的高热和化学分解处理中添加的化学试剂都会不同程度的引起大量蛋白质损失。

  通过单因素试验设计得出水溶性珍珠粉最佳水解条件为：珍珠粉用量1.5 g，酶解温度40℃，中性蛋白酶的第一次加入量0.23 g，酶解时间3 h 20 min，中性蛋白酶第二次加入量0.13 g，酶解时间3 h 20 min，酶解结束后，温度升高到90℃，加入3 m L乳酸，煮沸保温2h（温度为95℃—100℃），制备的水溶性珍珠粉氨基氮含量为10.13%。

2.5分子质量分布检测结果与分析

2.5.1未水解珍珠粉分子质量的分布

  未水解珍珠粉分子质量分布的高效液相色谱图如图1所示，未水解珍珠粉分子质量的分布不明显，无明显波峰。推测可能是珍珠粉中的主要成分是硬蛋白和大量的碳酸钙不溶于水，无法检测出分子质量的分布。

2.5.2水解后珍珠粉分子质量的分布

  水解后珍珠粉分子质量分布结果如图2所示，结合表5，质量含量为82.50%的水溶性珍珠粉分子质量主要分布为61～71 D a。由于珍珠粉水解后，主要成分是乳酸钙，所占比例较大。水解后的产品含有其它分子质量分布的物质，分子质量分布较为广泛，因此更有利于人体的吸收利用。

2.6未水解珍珠粉和水解后珍珠粉清除超氧阴离子能力的比较

2.6.1蒸馏水、未水解珍珠粉和水解珍珠粉的吸光度随时间的变化

  如图3所示，蒸馏水吸光度随时间的增加而增加，未水解珍珠粉和水解珍珠粉的吸光度随时间的增加而降低。

2.6.2珍珠粉清除超氧阴离子能力的比较

  水解后的珍珠粉自由基清除率，结果如表6所示，水解后的珍珠粉吸光度随时间的变化率为1.83×10-3%，清除超氧阴离子能力为15.07%。推测得出水溶性珍珠粉的抗氧化活性较为稳定，与未水解的珍珠粉相比较，清除超氧阴离子的能力有所提高。

3结论

  试验对水溶性珍珠粉的制备工艺、分子质量分布、抗氧化活性等作了研究与探讨，主要结论归纳如下：最佳水解条件为：珍珠粉用量1.5 g，酶解温度40℃，中性蛋白酶的第一次加入量0.23 g，酶解时间3 h 20 min，中性蛋白酶第二次加入量为0.13 g，酶解时间3 h 20 min．酶解结束后，温度升高到90℃，加入3 m L乳酸，煮沸保温2h(温度控制在95℃～100℃)的条件下，制备出的水溶性珍珠粉氨基氮含量为10.13%；质量分数82.50%的水溶性珍珠粉分子质量分布范围为61～71 D a;水溶性珍珠粉吸光度随时间的变化率为1.83×10-3%，超氧阴离子清除率为15.07%，水溶性珍珠粉抗氧化性能不显著，但抗氧化性能稳定。

4摘要  研究采用中性蛋白酶、乳酸水解珍珠粉，以水解度为指标，对加酶量、酶解温度、酶解时间、乳酸用量进行工艺参数优化制备水溶性珍珠粉，并测定其分子质量分布和清除超氧阴离子自由基能力。结果表明，最佳水解条件：珍珠粉用量1.5 g，酶解温度40℃，中性蛋白酶第一次加入量0.23 g，酶解时间3 h 20 min，中性蛋白酶第二次加入量0.13 g，酶解时间3 h 20 min，然后温度升高到90℃，加入3 m L乳酸，煮沸保温2h(温度95 ℃～100 ℃)，制备的水溶性珍珠粉氨基氮含量为10.13%。质量分数为82.5%的水溶性珍珠粉分子质量分布范围为61～71 D a，清除超氧阴离子自由基能力为15.07%。