作者：张毅
目前对生物处理过程中高效菌种的研究也越来越多，赵建筛选出可用于造纸废水处理的抗性菌株，出水COD和色度都稳定在一个比较好的水平，科研人员利用构建的优势降解菌群强化好氧颗粒污泥，提高制浆废水的降解效果，在厌氧处理的基础上，对原始好氧污泥处理后，废水CODcr由629 mg/L降至203 mg/L，废水色度由118 C．U．降至91 C．U.；而强化好氧污泥处理后，废水CODcr由629 mg/L降至146 mg/L，废水色度由118 C．U．降至72 C．U．。生物法处理制浆废水的关键是提高微生物对有机物的降解效率，筛选得到高效降解菌从而优化降解菌群。本研究将从污泥和APMP废水中提取出细菌，并筛选出高效菌株对其进行组合，找出降解效果最优的高效菌株的组合方式，达到高效处理APMP废水的目的。
1实验
1.1原料
实验菌种：从好氧活性污泥和APMP废水中筛选菌株。
实验废水：杨木APMP综合废水，pH值为9.O，CODcr含量为6960 mg/L，BODs含量为2920 mg/L。BODs:CODcr=0.42，大于0.3，可生化性较强。
1.2培养基
无机盐溶液：KH2P04 420 mg/L，K2HP04 375mg/L, (NH4)2S04 244 mg/L, NaC130 mg/L, CaCl2 30mg/L, MgS04 -H20 30 mg/L, FeCl3 -6H20 3 mg/L。
磷酸缓冲液( PBS)：NaCI 8g/L，KCl O．2 g/L，KH2P04 0.2g/L, K2HP04 1.15 g/L。
LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10 g/L。
LB固体培养基：在LB液体培养基中加入2%的琼脂粉。
以上试剂均在121℃条件下灭菌15 min。
1.3菌株的筛选
无菌操作条件下，用移液枪分别从好氧污泥和APMP废水中取50 μL，转入10 mL、50 mL、100 mL无菌水中进行梯度稀释，将稀释后的废水涂布于3个分离平板上（LB固体培养基），30CC条件下静置培养36 h。
根据菌落生长的稀密程度，确定最佳稀释浓度的分离平板，再以菌落的形貌为特征，从分离平板上选取不同菌落，采用划线稀释法将单一菌落接种于新分离平板上，以进一步筛选纯菌株，放入细菌培养箱，300C条件下静置培养36 h。将生长出来的菌落再次接种于斜面固体培养基中，静置培养36 h后，4℃保藏备用。
1.4菌株的扩大培养及菌体收集
将分离的菌株分别接种于LB液体培养基中，30℃条件下振荡培养(150 r/min)，待到对数生长期时，将包含菌体的培养液倒入150 mL经灭菌处理的离心管（121℃条件下灭菌20 min）中，5000 r/min条件下离心10 min，弃上清液，PBS缓冲液洗涤2次，收集菌体备用。
1.5菌体形态的微观观察
无菌操作下取出目标菌体，-80℃条件下冷冻干燥8h，喷金后
《中国造纸》2016年第35卷第1期利用扫描电子显微镜( SEM，JSM 5600 LV)观察各菌体的微观形态。
1.6菌株生长曲线的测定
微生物悬浮液中的菌体对透过菌株悬浮液的光线具有吸收作用，在一定范围内，菌悬液中微生物的细胞浓度与透过的光密度成正比，因此可以利用该原理测量样品溶液中的光密度，以此来代表菌株的生长曲线。
将筛选出的菌株在30℃、140 r/min的条件下进行培养，在600 nm下采用紫外可见分光光度计测定菌液的光密度值（OD600）。初始加入菌株的OD600为0.2，每隔4h检测其光密度值，当OD600不再增长时，停止检测。
1.7 APMP废水有机污染物的生物降解
分别取150 mL APMP废水至300 mL锥形瓶中，调节pH值为7.0，在121℃条件下灭菌20 min。将扩大培养后的菌株投加至废水中，使其在废水中的光密度值( OD600)为0.2，30C下振荡培养(150 r/min)，每隔6h取水样5 mL检测其COD值，至COD值不再下降时结束实验。
1.8废水的COD检测
采用重铬酸钾法进行测定。
1.9优势菌群筛选实验设计
运用部分因子设计( FFD)优化，通过Minitab软件对部分因子及全因子设计数据进行回归分析。
2结果与讨论
2.1从废水和污泥中筛选降解菌
将APMP废水和活性污泥适当稀释后涂布于LB固体培养基中，放入3℃培养箱，静置培养36 h，观察菌株生长情况，如图1所示。由图1可知，平板上生长出不同的微生物菌落，它们在菌落色泽、质地、形状、表面粗糙度等形貌特征方面存在明显差异。将不同菌落采用划线稀释法重新接种于分离平板上，进一步纯化菌株。
对取自APMP废水和好氧活性污泥中的菌株进行筛选、分离，总共得到了11株的微生物菌体，其中6种来自APMP制浆废水(Wl、W2、W3、W4、W5、W7)，5种来自好氧活性污泥(Sl、S3、S4、S5、S6)。
2.2菌株个体微观形态的观察
扫描电镜能够观察到菌株的个体外观形态、长度、宽度等基本特征，从而能够更好地分析筛选出来的菌株。各菌株的基本特征见表1。
图2是从APMP废水和好氧活性污泥中筛选出来的菌株的SEM图片。由表1和图2可知，11种菌株的长度范围为1.5～7μm，除W5、S3的宽度为0.5、2μm以外，大部分菌株的宽度为1μLm左右，Wl、Sl的外观形态相同，都是长棒状，前后粗细均匀，其余的9种菌株在外观形态方面各不相同，因此可以断定筛选出的1 1种菌株属于不同的菌种。
2.3菌株对APMP废水COD的去除效果
不同菌株对APMP废水COD的去除效果如表2所示。由表2可知，在筛选出的11株菌中，降解能力由大到小依次是：S4>W7>W2>Sl>S6>S5>S3> W4>W3>Wl>W5。其中，S4的降解效果最佳，处理120 h后，APMP废水CODcr由6960 mg/L降至3351 mg/L，去除率达到51.9%；菌株W7处理APMP废水120 h后，CODcr由6960 mg/L降至3445mg/L，去除率达到50.5%，菌株W2的CODcr去除率也高达50%。
根据各菌株在不同时间段的吸光度可知，W3、Sl、S3、S6基本没有生长，OD600在0.2左右徘徊，因此不适宜用作处理APMP废水的高效菌株，并且W5的生长状况良好，较Wl有生长优势，再根据表2各菌株对废水的处理效果，筛选出W2、W4、W5、W7、S4、S5这6种高效降解菌。
图3为这6种菌株对APMP废水COD的去除情况。从图3可以看出，大多数菌落在第120 h左右时的去除效果最好，因为此时大多数菌落处于稳定期，增长速度很快，所以降解效果最好。总的来说，随着时间的增长CODcr是不断降低的，然后保持稳定或略有增长。因为在稳定期细菌的生长和死亡呈动态平衡，所以CODcr基本不变，略有增长的原因是因为细菌死亡的速度大于生长速度。
2.4菌株生长曲线
菌株在一种溶液中的生长发育状况可以通过菌株的生长曲线来了解，菌株的4个生长周期分别为隐晦期、对数生长期、稳定期和衰亡期，通过菌株生长曲线的测量，可以推测菌株在不同时间的生长状况。一般处理废水大都采用处于稳定期的菌株，这个时期菌株的数量和周围环境达到了一个动态平衡，能够平稳地降低废水中的污染物质，从而达到降低废水COD的目的。
由图4各菌株的生长曲线图可知，W4、W5、W7、S4有着相似的生长规律，接种后的O～36 h为隐晦期，36～56 h为对数生长期，菌落开始快速增长，56～96 h为稳定期，细菌的生长和死亡呈动态平衡；S5、W2细菌的增长速度很快，接种后即开始增长，0~28 h为对数生长期，其后一直保持着稳定的增长速度，60~96 h为稳定期，细菌的生长和死亡呈动态平衡。
2.5统计学方法构建APMP制浆废水优势降解菌群
以W2、W4、W5、W6、S3、S4这6株菌作为分析因子，最高CODcr去除率（Rmax）为响应做6因素2水平的部分因子设计( FFD)实验，用于评估单株菌及混合菌对废水COD去除的影响，变量值如表3所示。
6因素全因子分析需要64 (26)组实验来评估主效应和交互效应，在本研究中，为减少工作量，选用部分因子分析设计，由16种实验构成的设计方案，在设计方案中，实验顺序随机排列，实验顺序详细信息及响应值Rmax见表4。
图5为不同菌株或菌株联合对废水COD去除率的正态概率图。在图4中对响应即COD去除率有显著影响的因子离正态概率线较远，这些影响因子对COD降解有重要贡献；对响应没有显著影响的因子离正态概率线较近，这些较近的点的影响可以忽略不计。
因此从图5可以看出，单变量W4、S4和S5对废水COD的去除有重要意义。此外，在这个模型中有3种显著的交互作用，分别是XlX4、XlX2和XlX2X6。在这3种显著的交互作用中，XlX4和Xl X2X6对Rmax产生积极的影响，而X1X2则有消极的影响。通过运用多元回归分析对实验数据进行分析并且忽略那些95%置信区间内不显著条件，从FFD中可以获得一个一价模型方程：
Rmax=32.64+7.77X2+9.15Xs+6.47X6+3. 29XIX4 -4.llXIX2 +3. 31XIX2X6
从方程中可以看出，Xi (W2)、X2 (W4)、X4( W7)、X5(S4)和X6 (S5)对APMP制浆废水
COD的降解都有不同程度的影响，而X3（W5）对废水COD的降解没有显著影响。因此，可选出W2、W4、W7、S4和S5这5株菌构建APMP制浆废水的优势降解菌群。
3结论
3.1 利用稀释倍数法和划线稀释法，从APMP制浆废水和好氧污泥中共筛选纯化出11株菌株，根据各菌株在扫描电镜下的图片分析其基本特征，并结合COD去除效果和生长曲线图筛选出W2、W4、W5、W7、S4、S5这6种高效降解菌。其中S4的降解效果最佳，处理APMP废水120 h后，CODcr由6960mg/L降至3351 mg/L，去除率达到51. 9%；菌株W7处理APMP废水120 h后，CODcr由6960 mg/L降至3445 mg/L，去除率达到50. 5%；菌株W2的去除率也高达50. O%。
3.2 以6株菌株为出发菌株用于降解APMP制浆废水中的有机污染物，先通过部分因子设计( FFD)实验，再运用多元回归分析，菌株W2、W4、W7、S4和S5是影响APMP废水降解有机污染物的主要因素，可用于构建针对APMP废水的优势降解菌群。摘要：从APMP废水及好氧污泥中筛选出11株微生物菌株，并检测它们降解APMP废水中有机污染物的能力。结果显示，菌株W2、W4、W5、W7、S4、S5具有较强的有机污染物降解能力，其中，菌株s4的降解效果最佳，处理APMP废水120 h后，CODer由6960 mg/L降至3351 mg/L，去除率达到51.9%。以这6株菌为出发菌株，结合统计学方法，采用6因素2水平的部分因子设计(FFD)实验，以最高CODcr去除率为响应值，考察单因素作用及多因素相互作用对废水降解的影响。结果表明，菌株W2、W4、W7、S4和s5是影响APMP废水有机污染物降解的主要因素，可用于构建针对APMP废水的优势降解菌群。
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