果胶一甲基丙烯酸丁酯接枝共聚结肠靶向骨架片的制备与研究

李辰，李坚斌，杨勇，刘健，杭方学

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

摘要：果胶一甲基丙烯酸丁酯在引发剂KPS的作用下接枝共聚，疏水性提高，为研究和开发新型结肠靶向载体材料开辟了新的途径。考察了共聚物的制备条件、物化特性和结构特征，制备了结肠靶向骨架片，评价了其释药性能。结果表明，果胶在KPS浓度为0.008 mol/L，BMA浓度为0.14 mol/L，温度为50℃和反应时间为4h条件下的接枝率最高，可达284. 87%。DSC表明，果胶与BMA接枝共聚后热稳定性降低，热焓增大；不同pH缓冲液的水溶性和溶液黏度随接枝率的增大而减小。SEM表明，PT -BMA颗粒表面呈现凹凸不平的蜂窝状结构，同时有颗粒连接的突起。FT -IR、1HNMR结果表明，疏水单体BMA成功接枝到果胶分子。PT -BMA骨架片的制备条件为：PT -BMA3为0.025 g，BSA为0.006 g，甲基纤维素为0.025 g，硬脂酸镁为0.001 g，压片压力为8 kqmm2。此时骨架片的结肠释药性较好。

关键词：果胶；甲基丙烯酸丁酯；接枝共聚物；骨架片；结肠；释药性能

    果胶是一种天然多糖，主要由半乳醛聚糖（光滑区）和鼠李-I（多毛区）组成，无毒，生物降解性和相容性优良，可控制血糖浓度，降低胆固醇，生产的伤口护理产品有抑菌和促使伤口愈合的效果，成为医药学领域研究的热点。在食品工业中常用作胶凝剂、乳化剂、稳定剂和增稠剂，也可制作可食的活性包装材料。

  果胶也是一种酸性多糖，天然易得，可循环利用，且能被结肠细菌群所产生的p-葡萄糖苷酶酶解，显示出结肠定位释放的功能，可作为结肠靶向药物载体材料。但水溶性差，不稳定，不能单独作为结肠药物载体材料，为提高果胶的性能，让果胶和其他物质如乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、白明胶、玉米蛋白、乳清蛋白、壳聚糖等聚合，或与二价或三价阳离子结合来提高果胶性能。Surajit Das等以Zn -果胶一壳聚糖复合微球为载体制备了白藜芦醇结肠靶向给药系统。张立彦等研究了离子对壳聚糖／果胶聚电解质复合物溶胀性及微观结构的影响，结果表明，离子价态对PEC得率的影响为：三价离子>二价离子>一价离子。张立彦等研究了氯化钠、硫酸钠、氯化铁制备壳聚糖／果胶聚电解质复合物( PEC)对牛血清蛋白(BSA)的负载能力及模拟释放行为，结果表明，含有3种离子物质的壳聚糖／果胶PEC均具有良好的pH敏感性和定点释放特性。

    在引发剂KPS作用下，通过果胶和甲基丙烯酸丁酯接枝共聚，笔者研究了其物理化学性、结构特征，并以其为原料，制备结肠靶向骨架片，考察了给药体系的体外释药性能。

1  材料与方法

1.1原料

    甲基丙烯酸丁酯( BMA)；乙醇溶液（配制），浓度为2.0 mol/L；过硫酸钾(KPS)水溶液（配制），浓度为0.2 mol/L；人工模拟结肠溶液；甲基纤维素；硬脂酸镁。

1.2主要仪器设备

    QM-3SP04行星式球磨机，南京大学仪器厂生产；TDP -120型单冲压片机，泰州市第三制药机械厂生产；Nexus 470傅里叶红外光谱仪，美国尼高立仪器公司生产；Bruker AV 600核磁共振仪，瑞士布鲁克拜厄斯宾有限公司生产；Netzsch DSC200PC差式扫描量热仪，德国耐驰仪器公司生产；Hitachi S -3400N扫描电子显微镜，日本日立公司生产；NDJ -79旋转粘度仪，上海平轩科学仪器有限公司生产；溶出度测定仪，上海黄海药检仪器有限公司生产。

1.3  实验方法

1.3.1PT -BMA接枝共聚物的制备

在引发剂KPS作用下制备PT -BMA接枝共聚物。配制浓度为0.2 mol/L的KPS水溶液和浓度为2 mol/L的BMA乙醇溶液。称取0.5 g果胶于反应器中，加入去离子水使其充分溶胀。然后在反应器中加入等体积的乙醇并搅拌至反应体系均一。在N2保护下边搅拌边加入KPS(1、2、3、4、5 mL)和BMA(1、2、3、4、5、6、7、8 mL)。在恒温(40、50、60、70、80℃)介质中密闭反应一段时间(1、2、3、4、5 h)后停止反应，冷却至室温后加入无水乙醇进行沉淀。沉淀一段时间后对聚合物进行抽滤分离，干燥后得粗接枝聚合物。再以丙酮抽提12 h除均聚物，50℃真空干燥至恒重得到产物PT -BMA，PT -BMA接枝率(G%)为：

式中，m1、m2分别是改性前与改性后果胶的质量，g。

1.3.2表面形貌观察( SEM)

    利用SEM观察PT -BMA接枝共聚物的表面形貌。称取等量的不同样品，分别在放大率为200×和15 000×下拍摄显微照片，操作步骤与Meneguin等所述方法相似并稍加修改，将样品用双面胶粘在平板上，在样品表面镀金，然后，在加速电压为10 kV下进行观察，记录。

1.3.3  红外光谱检测

    用傅里叶红外变换光谱检测果胶与甲基丙烯酸丁酯(BMA)的聚合作用。方法与Prezotti等所述方法相似，将不同样品与溴化钾粉末充分混合（质量比为1：100），置于玛瑙研钵中2—5 min，再灌注于单冲压片机中压片，将样品薄片置于傅里叶红外光谱仪上测试。扫描波数范围为4 000—650 cm-1，分辨率为4 cm-1。

1.3.4核磁共振分析

    取等量PT -BMAO和PT -BMA4的样品，分别用水溶解，用超导核磁共振谱仪进行核磁共振氢谱(1HNMR)的测定。高分辨率的IHNMR光谱被记录在超导核磁共振谱仪上，被测样品的制备按照Zheng等所述方法并加以修改，原果胶和接枝过的共聚物溶解在去离子水中，为了改变与重氢结合的不稳定质子，将溶液冷冻和解冻3次，在330 K记录他们的谱图。

1.3.5     PT -BMA接枝共聚物的物理化学性能

    (1) DSC分析

    选取PT -BMAO、PT -BMA2、PT -BMA4样品，用差示分析仪（Netzsch DSC200PC，德国）测定其热力学参数，以空白铝坩埚作参比，温度范围为20~350℃，升温速率为10 K/min，差示扫描量热曲线在氮气流量为50 mL/min下测定。此方法在Prezotti FG基础上加以修改。

    (2)水溶性、黏度的测定

溶解性以溶于水的质量分数来考察，SM计算式为：

式中，W为测试样品的质量，g；Wl为离心管的质量，g；W2为离心后的湿基沉淀和离心管的质量，g；W3为W2干燥后的质量，g。

    取BMA乙醇溶液1、2、3、4 mL所制备PT -BMA共聚物（1号样品PT -BMA 1、2号样品PT -BMA 2、3号样品PT -BMA 3、4号样品PT -BMA 4）各0.5 g，测定其在不同pH中的水溶性、黏度。不同的样品置于100 mL带盖离心管中混匀，加入50 mL人工模拟结肠液，置于37℃的摇床中，2h后离心(4 000 r/min，15 min)，上清液保留测黏度，离心管和湿基残留物置于60cC烘箱中烘干，称重，按式(2)测其溶解性，取样时间分别为4h和12 h。

1.3.6  骨架片的制备

  骨架片的制备与Newton'181所述方法相似并加以修改。取果胶、粘合剂（MC、EC、CMC、PVP总质量一定，果胶与粘合剂的质量比为5:1、4：2、3:3、2:4)、钙盐(CaCl2、CaS04)和BSA（固定骨架片中其他成分，BSA质量分别为0.004、0.008、0.012 g）按处方共混后，用2 010羟丙基甲基纤维素乙醇溶液制成软材，过40目筛，于50qC干燥2h，再过40目筛，与适量硬脂酸镁（总质量的10_10~2%）混匀后压片（压片压力为6、8 kgmm2和10 kg/mm2），制备成果胶载药骨架片。

1.3.7骨架片中BSA的体外释放研究

  采用《中华人民共和国药典》2010年版二部体外释放度试验方法第一法测定。将不同处方制备的果胶基骨架片置于500 mL的人工模拟缓冲液中，温度为(37.5±0.5)℃，调节转速为100 r/min。每小时取样1次，30 s内完成取样和补充等体积同温释放溶液。样液经0.8 um微孔滤膜过滤，以释放溶液作参比溶液，用最大吸收波长279 nm测定吸光度。各时间点校正后的累积溶出BSA百分数为：

式中，An为各时间采样点的药物溶出度；V1为各时间点的固定采样体积，mL；V2为溶出介质的体积，mL。

2结果与讨论

2,1 PT-BMA接枝共聚物的制备

  反应温度对接枝率的影响如表1所示。由表1可知，50℃时，果胶一甲基丙烯酸丁酯的接枝率最高，因此，以下操作均在50C下进行。

  在果胶原样质量为0.5 g，乙醇与水的体积各50 mL，反应温度为50℃的条件下，考察了BMA乙醇溶液体积、KPS溶液体积、反应时间对接枝率的影响，结果如图1所示。从图1可知，PT -BMA共聚物接枝率随反应时间增大而增加，反应4h后接枝率下降。遵循一般的自由基反应规律，在1—4 h内，引发剂KPS使分子共价键断裂而产生自由基，自由基与反应体系中的BMA作用生成新的分子和自由基，呈链式反应。反应一段时间，体系中的BMA单体和果胶骨架接枝位点减少，增大了自由基之间的相互结合，降低了体系的反应速度，当链终止速度等于链引发速度时，聚合物质量无明显变化。反应4h后接枝率降低是因为部分果胶分子逐步降解，果胶接枝链增长对活性位点有位阻效应，BMA单体不能顺利接枝。故选择反应时间为4h。

    从图1可知，KPS体积在2 mL前，PT -BMA共聚物接枝率随KPS体积的增加而减小；当KPS体积在2—4 mL时，共聚物接枝率随KPS体积的增大迅速增大；当KPS体积超过4 mL时，PT -BMA共聚物接枝率逐渐减小。这是因为，起始低浓度的引发剂只能引发少量的共价键均裂。KPS体积超过4 mL时，果胶分子上的活性位点数不再增加，而新的活性位点从BMA单体上产生，增强了BMA单体的均聚反应，PT -BMA共聚物接枝率降低。因此选择KPS体积为4 mL。

    从图1可知，PT -BMA共聚物接枝率随BMA体积的增大而增大，4 mL时增大速度最快，当体积大于6 mL时，接枝率降低。这是因为，一定范围内BMA单体浓度增加，增大了PT -BMA共聚物接枝反应速率和BMA单体之间的均聚反应速率，共聚速率大于均聚速率。当BMA单体浓度过高时，BMA单体均聚反应速度大于共聚速度，故BMA单体体积采用4 mL。综上所述，最佳条件为，温度为50℃，BMA乙醇溶液体积为4 mL，KPS体积为4 mL。

2.2 SEM分析

选取PT -BMA 0、PT -BMA 2、PT -BMA 4的果胶进行扫描电镜分析，结果如图2所示。

    从图2(b)、图2(e)中可知，PT -BMA分子表面有大量尺寸较均一的孔洞，部分孔洞黏附有条棍状颗粒，这是由于在于燥过程中，聚合分子收缩的缘故。BMA均聚形成BMA长侧链相互交联，表观上形成大量大小不均一的孔隙，原因是分子之间发生了相互作用，多糖聚合反应，分子之间的相互作用能够改变他们的机械性能和表面形态。与图2(b)、图2(e)相比，图2(f)中看到大量的孔隙，孔隙上面附着大量的由条状颗粒连结的突起。这是由于BMA接枝度的增大，破坏了果胶分子的空间构型，使PT -BMA更为松散，与文献[15]中所观察到的结果相一致，且BMA单体浓度的增大能产生大量自由基，更易发生共聚和均聚反应，从而形成分子质量大的长链，表观上为条状颗粒连接的突起出现。

2.3红外光谱检测

对PT -BMA 0、PT -BMA 2、PT -BMA 4的果胶进行红外光谱分析，结果如图3所示。

从图3可知，3种PT -BMA分子的红外吸收峰包含多糖类分子在3 800—3 200 cm一处的O-H键的伸缩振动强宽峰和l  200—1 000 cm-1处的C-O键的伸缩振动特征吸收宽峰。PT -BMA是果胶分子接枝甲基丙烯酸丁酯的产物，因此PT -BMA有甲基丙烯酸丁酯的特征红外吸收峰。甲基丙烯酸丁酯为不饱和酯，其特征红外吸收峰有酯基中的C-0伸缩振动（vc=o）和C-O单键伸缩振动峰( vc-o)。酯基中vc=o峰位于1 740 cm-1附近，而不饱和酯分子中的Av在1 725 cm-1左右，且酯基中y C-0峰在1 300—1 000 cm。1呈宽而强的双吸收峰，峰强度略强于酯中的vc=o峰。由于不饱和酯分子中vc=o峰分别出现在1 726. 82 cm-1( PT-BMA 2)和1727. 50 cm-1(PT -BMA 4)处，酯基中jt)c-0双峰与1146—1 100 cm-1处的糖苷键C-O-C非对称伸缩振动的吸收峰合频，所以在图谱中没有新的吸收峰，以上说明，BMA接枝上果胶分子。与文献[21]中的报道相似。

2.4核磁共振分析

选取PT -BMA 0和PT -BMA 4的果胶进行核磁共振氢谱(lHNMR)研究，结果如图4所示。

    由图4可以看出，在4.8~4.9 ppm处的峰为半乳糖醛酸的H一1，4.0~4.1  ppm处的峰为残余半乳糖醛酸H -2，H-3和H-4分别在3.7 ppm和3.6 ppm的位置，4.5~4.6 ppm处是残余半乳糖醛酸的H-5。由图4(a)、图4(b)的对比可知，PT-BMA中的氢均向低场发生化学位移。果胶多糖中的杂多糖种类多，单糖之间的连接顺序和连接位置以及侧链的不同，使果胶多糖结构复杂，鉴定困难。BMA单体分子中的-CH，、-CH2-和-OCH2-的质子吸收峰与果胶多糖分子中大量的-CH3、-CH，一和-OCH，质子吸收峰重合。果胶原样在化学位移为3. 56 ppm处的质子振动峰在PT -BMA氢谱中消失，这说明果胶分子骨架C2处的H受BMA侧链接入的影响。由此可知，BMA成功接枝上果胶分子。

2.5热稳定性( DSC)

选取PT -BMA 0、PT -BMA 2、PT -BMA 4的果胶进行DSC测试，结果如图5、图6所示。

  从图5中可以看出，果胶经BMA接枝处理后峰面积变化不明显，PT -BMA 0在32. 4CC和160~170 ℃出现了热吸收峰，而PT -BMA 2、PT -BMA 4均没出现，这说明BMA接枝处理后，由于聚合作用使果胶的物理化学性质发生了变化，Newton指出，热力学特征的变化表示聚合物之间的相互作用。在100℃吸热主要是果胶链的聚合作用，242℃放热因为聚合物的降解。从图6中可以看出，PT -BMA样品的To。、Tp和To均小于果胶原样，反应热焓大于果胶原样，其具体热力学参数如表2所示。这是因为PT -BMA的热稳定性取决于键能，BMA中含有较多能形成自由基的叔碳，增加了聚合物的稳定性，组装成了新的网状结构，但当PT -BMA中BMA质量分数很高时，PT -BMA的大分子键容易断裂，热稳定性降低。

2.6  BMA质量分数对PT -BMA共聚物水溶性、黏度的影响

不同pH条件下，不同样品对水溶性、黏度的影响如图7所示。

    由图7可以看出，样品在不同pH缓冲液的水溶性和溶液黏度随接枝率的增大而减小。PT -BMA聚合物在pH 6.8缓冲液的水溶性高于pH 7.4缓冲液中的水溶性，且pH 6.8缓冲溶液中的黏度大于pH 7.4缓冲液中的黏度。这是因为在pH 6.8接近中性的缓冲溶液中，游离羧酸成盐而增大了颗粒的水溶性，PT -BMA颗粒表面结构呈蜂窝状，PT -BMA聚合物能充分地伸展。在pH 7.4弱碱性缓冲溶液中，游离羧酸浓度降低，PT -BMA聚合物疏水性增强而降低了水溶性，因而水溶性低于pH 6.8的缓冲溶液。

2.7骨架片的制备

制备的骨架片如图8所示。

3结论

    制备果胶与甲基丙烯酸丁酯接枝共聚物的最佳条件为：KPS浓度为0.008 mol/L，BMA的浓度为0. 14 mol/L，温度为50C，时间为4h，接枝率可达284. 87%。共聚物的疏水性提高，热焓增大，为果胶作为结肠靶向载体材料提供依据。释药性能结果表明，0. 025 g PT -BMA 3、0.006 g BSA、0.025 g甲基纤维素与0. 001 g硬脂酸镁在8 kg/ITim2的压片压力下制备的骨架片有良好的结肠靶向性和生物降解性。