关于重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体免疫原性检测方法的研究

作者：张毅

     本研究选择实验室构建并表达的重组抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体TSLXK进行。这种嵌合抗体虽然通过人源化改造，减少了鼠源组分，但给药后仍然存在一定程度的免疫反应，导致抗药物抗体( anti-drug antibody，ADA)产生，尤其是在临床前动物实验中，由于种属差异，抗体更易产生。在治疗性蛋白质药物临床应用过程中，应对免疫原性给予关注，多家国际权威机构就蛋白质药物免疫原性的评价发布了指导原则。美国FDA建议采用多重检测法评价抗体药物的免疫原性，建立一种灵敏度高、操作简单快捷、通量高的筛选法，对临床样品进行初步筛选，筛选呈阳性结果的样品还须进一步采用确证法确定检测抗体特异性结合药物抗体。目前，抗体药物免疫原性检测方法很多，如桥连ELISA法、间接ELISA法、放射免疫沉淀法(RIP)、表面等离子共振法(SPR)等，各种方法都具有其优缺点。

    为评价TSLXK的免疫原性，我们建立了桥连ELISA法，对TSLXK临床前样品进行筛选，再以免疫清除法和交叉试验进行确证，实验结果显示该检测体系灵敏度高、重复性好、通量高，有望进一步应用于将来的临床试验研究。

1  材料和方法

1.1材料

    供试品重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体（TSLXK，批号20140402）及原研对照品利妥昔单抗注射液(Rituximab Injection Mabthera，批号H0135/SH0078)均由正大天晴药业集团股份有限公司提供，每瓶100 mg/10 mL，2-80C避光保存；阳性抗药物抗体（鼠抗Rituximab单抗，批号300914）购自BIO-RAD公司，-200C保存；空白食蟹猴血清由北京协尔鑫生物资源研究所提供；生物素标记试剂盒购自Dojindo Molecular Technologies公司；辣根过氧化物酶标记链霉亲和素( Streptavidin-HRP)购自R&DSystems公司；其他试剂均为国产分析纯产品。

    磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)：16 9 NaCI.0.4023 9 KCI、2.84 9 Na2HP04、0.544 9 KH2P04，溶解于2 L ddH：O;封闭液：用PBS配置5%脱脂奶粉；稀释液：用PBS配制l%牛血清白蛋白(BSA)溶液；显色液：TMB底物液A液与B液等体积混合；1 mo1/L硫酸终止液：将20.8 mL硫酸缓慢加入100 mL蒸馏水中，边加边搅拌；PBST洗板液：将0.5 mLTween-20加入999.5 mL PBS中。

1.2对照品及血清样本制备

    用含10%食蟹猴空白血清的PBS稀释液将鼠抗Rituximab抗体分别稀释至320、80、10 ng/mL，作为高、中、低浓度阳性对照样品；空白猴血清用PBS稀释至1/10作为阴性对照样品；血清样本用PBS稀释至1/10待测。

1.3  筛选法（桥连ELISA法）

    用PBS磷酸盐缓冲液将TSLXK或Rituximab稀释至5μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，用5%脱脂奶粉封闭，300 μL/孔，室温孵育2 h；PBST洗板3次，拍干，分别加入100 μL待测样品、阴性对照品及阳性对照品各3-6孔，室温孵育1 h；

PBST洗板3次，用1%BSA稀释生物素标记TSLXK/Rituximab至1/10万，100 μL/孔，室温孵育th；PBST洗板3次，用1% BSA稀释Streptavidin-HRP至1/200，100μL/孔，室温孵育20 min；PBST洗板4次，TMB显色，100μL/孔，室温反应15 min;加终止液100μL/孔，终止反应；酶标仪测定D450/560nm值。

1.4确证法（免疫清除法）

    筛选法检测结果为阳性的样本进一本采用此法进行确证。用PBS将TSLXK或Rituximab稀释至5μg/mL，μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，用5%脱脂奶粉封闭，300μL/孔，室温孵育2 h;TSLXK初筛为阳性酌食蟹猴血清样品分别用PBS和900μg/mL的TSLXK或Rituximab稀释至1/10，待测；PBST洗板3次，拍干，分别加入100μL待测样品、阴性对照品及阳性对照品，室温孵育1 h；PBST洗板3次，用1%  BSA稀释生物素标记TSLXK/ Rituximab至1/10万，100μL/孔，室温孵育1 h；PBST洗板3次，用1% BSA稀释Streptavidin-HRP至1/200，100μL/孔，室温孵育20 min;PBST洗板4次，TMB显色，100 μL/孔，室温反应15 min;加终止液100μL/孔，终止反应；酶标仪测定双波长D450/560nm值。

1.5免疫交叉

    为了考察ADA对TSLXK和Rituximah的免疫反应有无差异，将初筛结果呈阳性的血清样品交换包被药物，重新测定。在筛选法中，TSLXK和Ritux-imab给药组动物血清分别采用TSLXK和Rituximab包板进行检测；在免疫交叉反应中，则采用TSLXK包板检测Rituximab给药组动物血清，采用Ritux-imab包板检测TSLXK给药组动物血清，进而与初筛结果进行对比。

2结果

2.1  筛选（桥连ELISA法）

2.1.1  临界值的确定

    临界值(cut-off)是判定样品阴阳性的临界点，高于临界值判定为阳性，低于临界值则判定为阴性。对32只健康正常食蟹猴血清样品进行桥连ELISA法测定，样品平行测定3次，结果见图1。临界值等于每批测定的血清样品平均值加2倍标准差。由3批供试品TSLXK测得的数据得到的临界值分别为0.0143、0.0142、0.0144，取其均值，临界值设为0.0143;3批原研对照品Rituximab测得的数据得到的临界值均为0.0124，其临界值设为0.0124。

2.1.2临界值的归一化

不同检测批次的临界值不尽相同，为了得到更准确的判定结果，FDA建议对临界值进行归一化。根据Anthony介绍的归一化方法，临界值可进行归一化的必要条件是每批测定的血清样本信号值（即D450/560nm值）标准偏差一致。对32只食蟹猴血清样品进行3次平行检定，经方差分析，各组间的P值均大于0.05（置信区间95%），说明不同批次测定的血清样品信号值标准偏差一致，满足归一化条件。单一检测批次临界值等于本批次阴性对照样品平均D450/560nm值+归一化因子。其中归一化因子为上述临界值减去阴性对照品平均D450/560nm值，TSLXK检测的临界值为0.0143，阴性血清D450/560nm值为0.0107，归一化因子为0.0036; Rituximab检测的临界值为0.0124，阴性血清D450/560nm值为0.0097，归一化因子为0.0027。

2.1.3检测灵敏度本实验

    采用鼠抗Rituximab抗体作为阳性对照品，以反映该方法的灵敏度。用含1 0%食蟹猴空白血清的PBS缓冲液将鼠抗Rituximab抗体分别稀释为400、200、100、50、25、12.5、6.25 ng/mL。取100μL上述标准样品加入预先处理的酶标板中（方法详见1.3），根据标准曲线计算临界值所对应的阳性抗体浓度，即为该方法的检测限。

    以浓度为横坐标、D450/560nm值为纵坐标，双对数作图，线性回归得到标准曲线（图2）。TSLXK临界值(0.0143)所对应抗体浓度为0.35 ng/mL，因为血清样品测定时须稀释至1/10，故该方法测定血清中实际抗TSLXK抗体的检测灵敏度为3.5 ng/mL;对照品Rituximab临界值(0.0124)所对应的浓度也是0.35ng/mL，故该方法测定血清中实际抗Rituximab抗体的检测灵敏度为3.5 ng/mL。

2.1.4精密度与准确度

    精密度表示测定值之间的一致性或接近程度，一般用相对标准偏差( CV)表示；准确度表示测定值与真实值之间的符合程度，一般用相对误差(RE)表示。对阳性高、中、低对照进行3次重复检测，每个浓度6个平行孔，经计算不同浓度样本的板内或板间的CV均小于100，板内或板间的RE均介于±10%之间（表1），说明该方法具有较高的精密度与准确度，满足方法学要求。

2.1.5血药浓度对检测方法的影响

    血样中存在的药物（TSLXK或Rituximab）有可能会影响ADA的检测，因此需要考察样品中存在的TSLXK或Rituximab对免疫原性检测方法的影响程度。用含10%猴血清的PBS将TSLXK分别稀释至5000、1000、200、40、8、1.6μg/mL，将Rituximab分别稀释至320、64、12.8、2.56、0.512、0.102 ng/mL，进而用梯度稀释的上述含药溶液将鼠抗Rituximab阳性抗体稀释至320、80和10ng/mL，取100μL．加入已包被的酶标板孔中。图3为不同浓度的TSLXK和Rituximab对检测方法的影响。结果显示，二者的影响趋势基本相同，随着血中TSLXK或Rituximab浓度的增高，含有阳性抗体的样品的检测信号值逐渐降低，当药物浓度增加到一定程度时，检测信号值突降至临界值以下，产生假阴性结果（本批次临界值分别为0.0194和0.0148）。阳性样本所含ADA浓度越高(从10、80到320 ng/mL)，能够耐受的血清药物浓度越高（分别对应12.8、64和320 ng/mL），血清药物浓度一旦超过耐受浓度，则检测结果转为阴性。

2.2  筛选法检测结果

    表2为食蟹猴TSLXK重复静脉给药4周、停药恢复8周毒性实验中动物的分组情况，给药期每组10只动物（d29前），恢复期每组4只动物（d29后）。表3为毒代样本中ADA检测结果，测定D450/560nm值大于本批次临界值时，结果判定为阳性(+)，否则判断为阴性（-）。结果显示TSLXK低剂量给药组从给药后第15 d开始陆续检测到ADA，且动物抗体产生率达到90%；中剂量组仅有1只在药后22 d开始检测到抗体，另有2只在最后一个检测时间点产生抗体(d119)；高剂量组无抗体产生。Rituximab阳性对照组也有1只动物在药后22 d开始出现抗体，一直维持到实验结束。

2.3  确证法检测结果

    采用免疫清除法确证筛选法检测结果呈阳性的血清样品中是否确实含有抗药物抗体。在检测结果呈阳性的血清样品中加入过量TSLXK，若样品中含有ADA，则过量的TSLXK与包被的TSLXK竞争结合ADA，洗涤过程可将该部分液相中的结合抗体去除，包被TSLXK上结合的ADA减少，最终导致信号值降低。若加入过量TSLXK后信号值无显著差异，阳性结果可能是血清基质非特异性结合所致。

    对筛选法检测结果呈阳性的各采血点血清样品进行免疫清除试验，结果见图4，以不加TSLXK的检测孔所得D450/560nm值为横坐标，以同一样本加入过量TSLXK后所得D450/560nm值为纵坐标，绘制全部44个初筛为阳性样本的散点图。结果显示，不加TSLXK时，初筛为阳性的全部44个样品点D450/560nm值均大于临界值(0.0145)，介于0.189到3.648之间；当加入过量TSLXK后，信号值均显著降低，仅有3个样本点略高于临界值，其余均转为阴性。证实阳性样品中确实含有抗TSLXK或Rituximab的特异性抗体。

2.4免疫交叉反应

    TSLXK和Rituximab给药组动物血清在筛选法中分别采用TSLXK和Rituximab包板进行检测，初筛结果呈阳性的血清样品进一步交换包被药物，重新测定，考察ADA对TSI．XK和Rituximab的免疫反应有无差异。以TSLXK包被并检测所得D450/560nm值为横坐标，同一样本用Rituximab包被并检测所得D450/560nm值为纵坐标绘图（图5），结果显示供试品／原研对照品连续给药在食蟹猴体内均可以引发抗体产生，且二者与二者产生的抗体间存在交叉反应。2种检测方法均可以检测抗体，检测数值比较接近，在散点图上呈现一定的线性回归趋势。

2.5抗体滴度检测

    将经免疫确证后的阳性样本进行一系列梯度稀释，直至稀释至检测结果为阴性，则前一个滴度即为血清中抗TSLXK和Rituximab抗体的滴度。结果显示食蟹猴血清抗体的滴度从1：40-1: 1280不等，随时间延长，抗体滴度逐渐升高，给药后第119 d（最后一个检测时间点）抗体滴度达到最高值1：1280。

3讨论

    随着基因重组技术的引入，将抗体可变区转移至另一个抗体，使克服或减少鼠克隆抗体的某些局限性成为可能，将鼠抗体的可变区转移至人抗体的恒定区可以明显减少鼠源组分（大约减少2/3），从而生产一种被称为嵌合单克隆抗体的抗体。这种嵌合抗体尽管大大减少了鼠源部分，但仍然存在免疫反应。本研究建立了检测食蟹猴血清中抗CD52单克隆抗体免疫原性的检测方法并进行了确证，结果显示TSLXK与Rituximab连续给药后，部分个体产生针对TSLXK和Rituximab的特异性抗体，且随时间延长抗体滴度逐渐增高。低、中、高剂量组随剂量的增加，抗体产生率明显降低，说明连续静脉给予抗CD20单克隆抗体后，剂量对抗体的产生存在较大影响，低剂量连续给药更易诱发抗体产生。TSLXK和Rituximab相同剂量给药后，TSLXK没有抗体产生，而对照品Rituximab却有1只动物出现抗体，考虑到动物样本数有限且动物本身存在较大的个体差异，要判断差异存在，尚须进一步研究。

    由于抗CD20单抗在体内半衰期较长，一段时期内猴体内会存在较高的血药浓度，需要考察血药浓度对ADA检测的影响。方法学确证表明，供试品和原研对照品血清中的药物浓度对抗体检测的影响水平一致，阳性样本所含ADA浓度越高，能够耐受的血清药物浓度越高，血清药物浓度一旦超过耐受浓度，则检测结果转为阴性。药物与ADA本质卜均为抗体，两者分子大小接近，提示体外ELISA实验中，药物与ADA的结合比例接近1:1，一旦血清中所含药物超过所含ADA，即可干扰ADA的检测，产生假阴性结果。血药浓度较高时虽然对抗体检测有影响，但只是增加了假阴性率，不会增加假阳性率，所以检测结果为阳性的样本是可信的。

桥连ELISA法只是作为大量临床样品免疫原性的初筛，若样品检测结果为阳性，还须采用确证法确证血清中抗CD20单抗特异性抗体的存在。本实验采用免疫清除作为确证方法，降低了假阳性的发生。桥连ELISA和免疫清除法的联合，可以更好更客观地评价药物的免疫原性，也是目前国内临床常用的方法之一。根据新的指导原则，免疫原性检测过程中需要加入免疫交叉试验，本实验将实验中检测并确证为阳性抗体的样本进行了免疫交叉试验，结果表明，供试品／原研对照品连续给药在食蟹猴体内均可以引发抗体产生，且二者与二者产生的抗体间存在较高的交叉反应率，这从另一方面证实供试品与原研对照品的结构和免疫反应性高度一致。

4[摘  要]  目的：建立一种灵敏、特异、操作简单的FI．ISA方法，用于检测食蟹猴血清中抗CD20单克隆抗体的免疫原性。方法：首先采用桥连ELJSA法对抗药物抗体(ADA)进行定性筛选，以抗CD20单克隆抗体作为包被抗体，以生物素标记的抗CD20单克隆抗体作为检测抗体，二者共同结合血清中存在的ADA．以D450/560nm值超过临界值作为阳性判断标准；初筛为阳性的样本采用免疫清除法进一步确证，并同时进行免疫交叉试验考察ADA对供试品和原研对照品的免疫反应有无差异。结果：建立了检测ADA的筛选方法和确证方法，确定了检测的临界值和归一化因子，血清中抗药物抗体的检测灵敏度达3.5 ng/mL，批内／批间精密度介于3.l%-7.4%，准确度介于-1.2%~9.5%；食蟹猴连续给药后，部分个体产生特异性抗体，且抗体滴度随时间延长而增高、结论：建立的ADA筛选方法和确证方法可用于毒性试验的免疫原性检测；动物给药剂量对抗体的产生有较大影响，低剂量连续给药更易诱发特异性抗体产生。