作者：郑晓敏
利用融合表达方法不仅可以大大提高目的蛋白的表达量，同时在避免被蛋白酶降解以及辅助目的蛋白折叠方面都有优势。同SUMO基因进行融合表达是一种新型融合表达方式，SUMO蛋白能够帮助目标蛋白正确折叠，提高目标蛋白的表达量。在本研究中，我们将5端含有羟胺切割点的hNGF-β基因同SUMO基因在大肠杆菌中融合表达，通过优化表达条件获得了高表达的融合蛋白。为了获得SUMO蛋白和hNGF-β独立的空间结构，并且方便hNGF-β的纯化，在SUMO蛋白与b亚基间加入了含有36个氨基酸残基的linker序列和羟胺切割位点。在变性条件下对初步纯化的SUMO-hNGF-β融合蛋白进行羟胺裂解，通过阳离子交换层析二次纯化后，获得了高纯度重组hNGF-β。
1材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌BL21( DE3)，表达质粒pET-SUMO、pBV220-hNGF-β系本室保存；限制性内切酶Sal I、NotI，T4DNA连接酶为Progema公司产品；TaqDNA聚合酶和dNTP购白TaKaRa公司；羟胺、Tris试剂为Sigma公司产品；PCR引物南上海生工生物T程公司合成；兔抗hNGF-β多克隆抗体、HRP标记羊抗兔IgG购自华美生物工程技术公司；His标签亲和色谱填料购自Pharmacia公司；其他生化试剂均为国产分析纯产品。
1.2引物设计
根据GenBank报道的成熟hNGF-β核酸序列(Gene ID：4803)设计合成针对hNGF-β的特异扩增引物，并在hNGF-p基因的5'端引入羟胺切割位点，在引物的两端引入限制性内切酶位点，将终止密码子TGA改为大肠杆菌偏性的TAA。引物P1（5'-ACGCCTCGACAACGGTTCATCATCCCATCC-3'）含有.Sal I位点（斜体）和羟胺切割序列（下划线），引物P2(5'- CGGCGCCCGCTTAGCACCACGCAC- 3')含有Not I位点（斜体）。
1.3 表达质粒pET-SUMO-hNGF-β的构建
以本室保存的质粒pBV220-hNGF-β为模板，通过PCR方法扩增hNGF-B基因序列，以Sal I /Not I双酶切回收PCR产物，然后通过T4DNA连接酶的作用，把酶切回收产物克隆到经同样酶切的表达质粒pET- SUMO中，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆进行测序。对纯化的PCR扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
1.4 SUMO-hNGF-β融合蛋白的表达和纯化
将序列正确的阳性克隆菌落活化后按1:50的比例接种与含卡那霉素的LB培养基1000 mL中，37℃振摇培养，当菌液D600n达0.5时，加入IPTC至终浓度为0.4 mmol/L，于37℃继续诱导7h，离心收集细菌，沉淀菌体溶于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液中，常规超声波破碎，离心分别收集上清和沉淀，分别加入等体积的PBS缓冲液，加入上样缓冲液煮沸5 min，以140 SDS-PACE分析目的蛋白的表达量和表达形式。融合蛋白包涵体溶于50 mmol/L Tris-HCI、8 mol/L尿素(pH8.0)溶液中。由于融合蛋白N端带有6xHis标签，通过镍离子螯合的亲和层析柱对融合蛋白变性混合液进行纯化。分别用30、150mmol/L咪唑的变性液洗脱杂蛋白和目的融合蛋白，收集穿过峰和洗脱峰蛋白，进行14% SDS-PACE，分析纯化的融合蛋白的纯度。
1.5 SUMO-hNGF-β融合蛋白的羟胺切割
用羟胺裂解溶液（2 mol/L羟胺，50 mmol/LTris-HCl，8 mol/L尿素，pH9.5）将纯化的融合蛋白稀释至约1 mg/mL，42℃裂解7h后，用盐酸将溶液调至pH8.0以终止裂解反应，取裂解后的蛋白混合液进行14% SDS-PAGE，分析羟胺切割效率和切割特异性。
1.6 SUMO蛋白与hNGF-β亚基羟胺切割后共复性
SUMO蛋白具有分子伴侣的性质，含有高度疏水的核心，为目的蛋白的折叠提供成核位点，提高外源蛋白的稳定性。利用SUMO蛋白分子伴侣的功能，在变性条件下将SUMO与hNGF-β进行共复性。羟胺切割的混合变性溶液加入β-巯基乙醇至浓度为10 mmol/L，将蛋白混合物放入复性液中进行透析复性（pH8.0复性液组成：25 mmol/L Tris-HCI，0.1 mmol/L NaCl,0.5 mmol/L EDTA,1 mol/L尿素，0.1 mmol/L GSSG，0.2 mmol/L CSH)。复性过程中每4h更换透析液，计4次。4℃放置24 h左右，高速离心除去沉淀。
1.7 hNGF-β的SP离子交换层析纯化
hNGF-β的等电点约为9.4，故采用SP阳离子交换层析对复性后的hNGF-β进行二次提纯。上清液用50 mmol lL Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液透析后，13 000 r/min离心20 min;将透析后复性上清上样，流速3.0 mL/min，待穿过峰过后，用TE缓冲液( pH8.0)平衡色谱柱；用NaCI进行梯度洗脱，分部收集各洗脱峰，0.4 mol/L NaCl附近出现目的峰；取目的峰样品1：10稀释后加入5×上样缓冲液煮沸，取15 μL分别进行14%还原和非还原SDS-PACE检测纯度。
1.8 单链hNGF-β的Western印迹鉴定
取纯化的SUMO-hNGF-β融合蛋白、羟胺切割后的融合蛋白及纯化的hNGF-β进行14% SDS-PAGE，半干法转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉于37℃封闭1 h，抗原抗体反应中的一抗为兔抗hNGF抗体，二抗为羊抗兔IgG-HRP，ECL暗室自动曝光显影，验证各蛋白的抗原性。
2结果
2.1 原核表达载体pET-SUMO-hNGF-β的构建
以质粒pBV220-hNGF-β为模板，PCR扩增得到成熟人hNGF-β3核酸片段，10 g/L琼脂糖电泳显示在约360 bp处有单一的电泳条带（图1）。将克隆连接产物转化至表达宿主感受态大肠杆菌BL(DE3)，筛选阳性克隆，测序结果与成熟的hNGF-β核酸序列完全一致（序列略）。
2.2 SUMO-hNGF-β融合蛋白的表达和纯化
取阳性克隆菌落接种于含卡那霉素的LB培养基中，370C振摇培养至菌液D600nm为0.5时，加入IPTG继续诱导7h后离心收集细菌，超声波破碎，SDS-PAGE结果表明重组蛋白主要以包涵体形式存在，相对分子质量为39xl03，约占细菌总蛋白的35%（图2）。
SUMO蛋白1的N端带有6xHis标签，利用金属离子螯合的亲和层析柱对融合蛋白进行亲和纯化。融合蛋白包涵体溶于50 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素溶液( pH8.0)中，分别以不同浓度的咪唑+50mmol/L Tris-HCI、8 mol/L尿素溶液洗脱杂蛋白和目的融合蛋白，收集穿过峰和洗脱峰蛋白，14%SDS-PACE结果表明经初步亲和纯化后目的蛋白SUMO-hNGF-β的纯度达80%以上(图3)。
2.3 SUMO-hNGF-β融合蛋白的羟胺切割
将融合蛋白的包涵体溶解于羟胺裂解}昆合溶液中，420C切割Sh，取切割后的蛋白混合液进行14%SDS- PAGE，SUMO-hNGF-β的羟胺切割效率约为60%，切割的特异性较高，没有出现非特异切割条带，在相对分子质量约14x103处有日的蛋白hNGF-β（图4）。
2.4重组hNGF-β复性后阳离子交换纯化
融合蛋白SUMO-hNGF-β经羟胺切割后进行透析法共复性，在复性过程中作为分子伴侣的SUMO可以辅助hNGF-β形成正确的空间折叠，这样可以提高hNGF-β的复性率。原核表达的hNGF-β包涵体复性率一般约为1 0%，我们利用共复性方法使hNGF-β的复性率达到30%左右。随后在4℃条件下采用SP Sepharose Fast F-low阳离子交换柱对复性后的hNGF-β进行二次纯化，在pH8.0缓冲液体系条件下上样和洗脱日的蛋白，当洗脱缓冲液NaCI浓度为0.4 mo1/L时出现目的峰，14%还原SDS-PAGE(图5)检测发现洗脱的目的蛋白hNGF-β纯度可达80%以上。非还原电泳检测发现超过70%的重组hNGF-β获得分子问二聚体配对（图6）。
2.5 Western印迹鉴定重组hNGF-β
将牛血清白蛋白(BSA)（作为无关蛋白）、融合蛋白SUMO-hNGF-β、羟胺切割后的融合蛋白及纯化的hNGF-B经SDS-PACE后转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭，进行一抗、二抗结合反应，曝光显影。Western印迹显示，融合蛋白、切割后的混合蛋白及纯化的hNGF-β均能与hNGF抗体结合（图7）。
3讨论
利用原核系统获得基因工程产品的关键是目的蛋白的高表达、易纯化和良好的生物活性，而高表达是基因工程技术的前提。一类细胞因子由于基因自身mRNA稳定性低、空间结构复杂，以及含有原核系统较多的稀有密码子等因素，使其在原核系统内的表达量非常低。其次，对于一些富含二硫键的蛋白分子而言，二硫键的形成是蛋白质生物合成的一个重要步骤，二硫键还与蛋白质能否折叠和组装成具有生物学活性的结构并稳定这种结构有着密切的联系，在蛋白质的结构维持和活性保持方面起重要作用。hNGF-β含有3组二硫键，且其编码基因的5'端带有较多的大肠杆菌翻译稀有密码子，目前虽然有利用基因工程方法获得重组hNCF的报道，但都是用昆虫、酵母细胞等真核系统进行表达，在原核系统内，hNGF-β的表达量非常低日．基本没有生物活性。采用融合表达的方法不仅可以大大提高目的蛋白的表达量，还可以防止外源蛋白被蛋白酶降解，从而有利于维持表达产物的稳定。因此，选择适合目的蛋白的融合分子就尤为关键。存在于真核细胞中的SUMO蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白，参与调节细胞凋亡、信号转导、RNA转录、蛋白的核质运输等多种生理功能。SUMO具有高的热稳定性和分子伴侣功能，作为融合标签与外源蛋白融合表达，可明显提高外源蛋白的稳定性和可溶性。目前利用SUMO融合标签已成功获得了SARS CoV 3Cl蛋白酶、CFP、金属蛋白酶MMP13的高效表达。本实验中，为了使hNGF-β在原核系统内高表达，我们将hNGF-β与SUMO串联在一起进行融合表达，获得的融合蛋白的表达量高于细菌总蛋白的30%，表达产物以包涵体形式存在，因此加入了在变性条件下可以切割的羟胺位点。利用SUMO蛋白的分子伴侣特性，将SUMO与hNGF-β共复性，大大提高了hNGF-β的复性率，复性率达到30%左右，远远高于在常规复性条件下1 0%复性率的水平。Western印迹结果说明利用伴侣分子共复性的方法获得的重组hNGF-β具有良好的抗原特性。本研究也可为利用原核系统生产其他表达量和生物活性都比较低的基因工程产品提供参考和实验依据。
4[摘要] 目的：在原核系统内表达SUMO融合重组人神经生长因子p亚基(hNGF-β，并对其纯化。方法：将5'端引入了羟胺切割位点的hNCF-[3基因克隆到表达载体pET-SUMO中，IPTCJ诱导表达后，对表达的融合蛋白SUMO-hNGF-β包涵体进行亲和纯化，然后在变性条件下加入羟胺进行裂解，利用SLM()分子伴侣的功能与hNCJF-B进行共复性，最后利用阳离子交换层析纯化获得重组hNGF-β。结果：融合蛋白SUMO-hNGF-β相对分子质量为39xl03，表达量占细菌总蛋白的35%；在变性条件下经羟胺切割、共复性和阳离子纯化后，相对分子质量为14xio:的重组hNGF-β复性率和纯度分别为30%和80%以上，Western印迹显示其具有良好的抗原特性。结论：HNGF-β与SUMO融合可以在原核表达系统中实现优势表达。
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