作者：郑晓敏
在传统生产工艺中，主要利用化学方法以洛伐他汀为原料合成得到辛伐他汀，但近年来逐步转向能耗低、毒性低的酶法生产。专利W02005/040107报告了使用酯酶作为酯化剂合成辛伐他汀，但是由于区域选择性酯化的要求使得必须进行其他醇基的保护，导致总产量的降低。因此，找到能够选择性酰化莫那可林酸的特效酶制剂，对于有效合成辛伐他汀将起到至关重要的作用。
土曲霉的洛伐他汀生物合成基因簇编码的一个相对分子质量约46 000的蛋白即洛伐他汀酰基转移酶(lovastatinacy transferase，LovD)，可将酰基硫酯的酰基基团区域选择性酰基化莫那可林酸C8羟基，为生物合成辛伐他汀提供有效的酶制剂。后来将LovD基因构建到大肠杆菌中，其工程菌应用到从莫那可林酸到辛伐他汀的合成过程中。后续高雪研究了以大肠杆菌为宿主的LovD的86、12、190、275、26、161等位点的定点突变，其突变体有效改进了LovD的活性、温度稳定性及可溶性181。
本实验室从LovD的原始序列出发，根据三维构像推测影响酶活的关键性位点，进行定点突变，获得比原始序列酶活高出数倍的突变大肠杆菌菌株，但大肠杆菌工程菌容易受环境影响。目前LovD的研究主要在大肠杆菌里进行表达发酵，国内外尚无将此基因在毕赤酵母中表达的研究报道。巴斯德毕赤酵母表达系统作为一种真核表达系统，具有培养条件简单、易于操作、适应性强、便于高密度发酵培养和工业化生产等优点。已有多种蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中得以高效表达。我们从经过多次突变优化的LovD基因出发，将其分别构建到胞外表达载体pPIC9K和胞内表达载体pA0815中，筛选出合适的表达载体，实现了基因在宿主菌中的功能性表达，获得了高效表达的基因工程菌，并初步进行了SL自动发酵罐放大试验，以期为LovD的大规模生产奠定技术基础。
l 材料和方法
1.1材料
巴斯德毕赤酵母GS115，质粒pPIC9K、pA0815购自Invitrogen公司；含有突变的LovD基因的质粒pET-2ld-/ovD为本实验室构建并保存。
酵母提取物和蛋白胨购白OXOID公司；其他化学试剂均购自上海国药集团化学试剂有限公司；rTaq DNA酶、Probest高保真聚合酶、dNTP混合物、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；限制性内切酶EcoR I、Not I、SaI I均购白NEB公司；溶壁酶(lyti-case)购自Sigma公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖回收试剂盒购自北京天根有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；LB、YPD、BMGY、MD等培养基配方参考《分子克隆实验指南》（第3版）。
ZSOI- 0057电泳仪、Gene PulserⅡ电穿孔仪（Bio-RAD公司）；琼脂糖电泳仪（北京六一仪器厂）；SL搅拌式发酵罐（上海保兴生物设备T程有限公司）；LT低温连接仪（珠海黑马医学仪器有限公司）。
1.2 LovD基因的毕赤酵母重组质粒构建
根据突变的LovD基因序列及毕赤酵母载体的多克隆位点分别设计2组引物，即引物L1（5’-CCTGAATTCATGGGTTCTAACATTCJACGCAG-3’，下划线碱基为EcoR I识别位点），L2（5--CCTGCGGCCGCTTAGCCCTCTTGCTATTGTGCA-3’，下划线碱基为Not I识别位点）、L3（5’-CCTCAATTCATGGGTTCTAACATTGACGCAG-3’，下划线碱基为EcoR I识别位点）、L4(5’- CCTGAATTCTTACCCCTGTTGCTATTGTGCA-3’，下划线碱基为EcoR I识别位点)，以pET-2ld-LovD（本实验构建保存）为模板，扩增LovD基因，用回收试剂盒回收该PCR产物片段，将回收的PCR产物与表达质粒pPIC9K和pA0815分别用NotI lEcoR I双酶切和EcoR I单酶切，用T。DNA连接酶将表达载体与酶切产物连接，转化感受态大肠杆菌TOP10，然后在含氨苄西林(50μg/mL)的LB平板培养基上筛选阳性克隆，利用相应引物进行菌落PCR及酶切重组质粒验证，将正确的菌株送上海英骏生物技术公司测序，测序结果正确，即得到重组表达载体pPIC9K-/ovD和pA0815-LovD。
1.3 LovD的毕赤酵母转化及鉴定
将毕赤酵母GS115单菌落挑入YPD培养基中活化后，按0.5%的接种量接入50 mL YPD培养基中培养至对数期，离心获得的菌体用20 mL无菌水洗2次，再用20 mL无菌l mol/L山梨醇洗1次，加入1mL山梨醇重悬菌体获得GS115感受态细胞。
将大肠杆菌TOPIO（pPIC9K- LovD）和TOPIO（pA0815-LovD）置于LB液体培养基中，37C、200 rlmin振荡培养过夜，提取重组质粒，用SZ I内切酶线性化重组质粒。
将线性化pPIC9K-LovD和pA0815-LovD的重组质粒加入80μL (;S115感受态细胞中冰浴5min，1500 V电击5 ms转化，加入800μL由梨醇将细胞洗至EP管中，28C温育2h，离心，涂MD平板培养至长出菌落后，划线分离出单菌落。
将单菌落挑人无菌水中，加入适量溶壁酶，37℃温育1h消化细胞壁，取部分消化产物为模板、片段引物为鉴定引物进行PCR，检测阳性克隆。
1.4重组毕赤酵母菌的摇瓶诱导表达
分别挑选8株阳性重组菌接人2 mL YPD液体培养基活化2d，以1%的接种量转接30mL BMGY( pH8.0)液体培养基中，200 r/min、280C过夜培养，每隔24 h补加1%甲醇进行诱导，共诱导72 h，收集菌液，用于酶活测定。
1.5酵母表达的LovD粗酶液的制备
1.5.1 pPIC9k- LovD胞外表达重组茵粗酶液制备取2 ml。发酵菌液，12 000 r/min离心10 min，收集上清用于酶活测定。
1.5.2 pA0815-LovD胞内表达重组菌粗酶液的制备 取2 mL发酵菌液，离心收集菌体，用lmL0.05 mol/L磷酸钠缓冲液(pH8.5)重悬，加入适量酸洗玻璃珠振荡破碎20 min，离心上清作为粗酶液。
1.6 LovD酶活测定
反应体系参考文献并改进。总反应体积为5mL，内含4 mg/mL莫那可林酸、0.008% DMB- S-MMP及2 mL菌液所得上清，以pH8.5的400 mmol/L三乙醇胺缓冲溶液补足。在25℃、磁力搅拌条件下反应30 min，然后取100μL，加入900μL磷酸二氢钾一乙腈溶液，进行高效液相色谱(HPIC)检测。
色谱柱为菲罗门公司的C18柱(4.6 mmx 33mm，3 μm)，流动相为0.1%醋酸水溶液：乙腈(40:60)，等度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长238 nm，柱温25℃，进样量10μL。以辛伐他汀铵盐(97.6%)为标准品，以单点校正方法计算反应后辛伐他汀的含量酶活定义：在25℃、pH8.5条件下，每分钟催化生成1mol辛伐他汀所需酶量为1个单位(U)。
1.7重组毕赤酵母菌的发酵罐放大实验及酶功效实验
以筛选到的高酶活胞外表达重组子为出发菌株，接种到150 mL YPD液体培养基中，280C过夜培养，制成种子液，以5%的接种量接入3 L BMGY液体培养基（SL发酵罐）中，发酵过程中流加28%氨水控制pH值，以甘油为碳源。菌体生长阶段温度设定为28℃，pH设定为5.0，待培养18 h后甘油耗尽（溶氧陡然上升）后继续补加约50%的甘油。诱导产酶阶段温度设定为25℃，pH设定为7.0，当溶氧再一次上升时，流加甲醇至发酵液中进行诱导，在发酵过程中适时调节甲醇流速使溶氧保持在20%以上，发酵过程中每隔12 h取样测定酰基转移酶活性。
收集发酵罐菌体，12 000 r/min离心10 min，收集上清，用lOk膜超滤浓缩，将浓缩后的上清冻干，制成冻干粉，用于辛伐他汀酸合成实验。
将莫那可林酸溶于pH8.5的400 mmol/L三乙醇胺缓冲溶液中，终浓度为60 mg/mL，待其完全溶解后加入冻干粉，使酶浓度达到7 mg/mL，搅拌10 min后加入一定量的活性炭，搅拌5 min，加入侧链DMB-S-MMP，其终浓度为0.044%，反应总体积为100 mL左右，HPLC检测辛伐他汀的生成。反应结束，计算莫那可林酸转化率：（初始投入反应时莫那可林酸的含量一莫那可林酸的剩余含量）/初始投入反应时莫那可林酸的含量。
2结果
2.1 LovD基因的PCR扩增
根据LovD基因序列及毕赤酵母载体的多克隆位点分别设计了2组引物进行PCR扩增，PCR产物经8 g/L琼脂糖凝胶电泳，结果如图1，扩增到1200bp左右的条带，其大小与预测结果一致。
2.2 重组表达质粒pPIC9K-LovD和pA0815-LovD的鉴定
将重组质粒pPIC9K-LovD用限制性内切酶Not I /EcoR I双酶切，将pA0815-LovD用EcoR I单酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，前者可见含1200bp左右的基因条带和约9900 bp的载体条带(图2A)，后者可见含1200 bp左右的基因条带和约7700 bp的载体条带（图2B），说明目的基因已成功插入载体。测序结果证明插入位点正确且无突变。
2.3 重组毕赤酵母菌的摇瓶表达及活性测定
分别挑选8株阳性重组酵母菌，在BMGY培养基中进行摇瓶发酵，诱导72 h后测定其合成的辛伐他汀的活性。结果显示，胞外表达菌和胞内表达菌各重组子之间的酶活力无明显差异，将各重组子的酶活取平均值如图3所示，胞外重组酵母菌的酶活是胞内重组酵母菌的近3倍，其合成的辛伐他汀的酶活可达52 U/L，说明毕赤酵母的胞外表达系统更适合LovD。
2.4胞外表达重组酵母菌株发酵罐放大实验
以筛选到的高酶活胞外表达重组子为出发菌株，接种到150 mL YPD液体培养基中，28C过夜培养，制成种子液，然后以5%的接种量接人3L的BMGY( pH8.0)液体培养基（SL发酵罐）中，诱导96 h时，发酵液中酶活达到了最大值，为609.3 U/L，随着诱导时间的延长，酶活力趋于稳定（图4），因此确定96 h为摇瓶发酵最佳诱导时问。
2.5 LovD的功效实验
重组酵母菌株菌液经收集、浓缩、制成冻干粉，用于辛伐他汀合成，经过45 h反应后，结果如图5所示。反应结束时，莫那可林酸的转化率可达96%，酵母表达的LovD可很好地催化莫那可林酸生成辛伐他汀，反应物中的杂质较少。
3讨论
国内外学者已对LovD的原核异源表达进行了一些研究，其出发基因序列均为土曲霉来源的酰基转移酶氨基酸序列。在此基础上，进行了突变等研究。2007年，Xie等通过构建的大肠杆菌BL21( DE3)/pAW31表达菌株，进行了全细胞催化莫纳克林酸生成辛伐他汀的实验探索，底物浓度为5 g/L时转化率达gg%，产品浓度可达98%。但其仅为小试实验，并无后期放大化实验结果。2010年，华东理工大学的朱丽平在该研究基础上，从多个方面对发酵培养基和发酵条件进行优化，提高大肠杆菌BL21菌株中的酰基转移酶LovD的表达，最终酶活仅为250 U/L，辛伐他汀合成转化率为90%。本研究中LovD基因来源于实验室进化保存，区别于上述学者的突变位点。本研究中底物浓度为60 g/L时，转化率达到了96%以上，具备工业化应用指标。研究发现，大肠杆菌内存在可降解侧链DMB-S-MMP的未知酶，因此产物中含有侧链的分解产物DMB-S-MPA，不利于后续分离。本研究所构建的毕赤酵母胞外工程菌株，由于其自身蛋白分泌较少，杂蛋白较少，用于催化辛伐他汀合成实验不会造成对侧链的降解，因此产物的杂质较少，利用后续纯化，且产物收率高，可克服大肠杆菌发酵工业生产中存在自身蛋白表达多、后处理较为复杂，特别是在气候条件、温度湿度等方面也较为敏感，易被噬菌体感染等问题。在后续的工业化生产中，炯台只楚药业已利用本公司开发的相关酶进行了辛伐他汀工业化生产验证，其产品纯度达到了99%以上。因此，本研究所构建的毕赤酵母工程菌，为LovD的表达提供了一条新途径，为生物法合成辛伐他汀工业化生产奠定了基础。
4[摘 要] 目的：构建并筛选高效表达洛伐他汀酰基转移酶( LovD)的毕赤酵母重组菌株。方法：将突变的LovD基因克隆到毕赤酵母胞外表达质粒pPIC9K和胞内表达质粒pA0815中，将重组表达质粒电转入毕赤酵母GS115中，得到毕赤酵母重组菌株，通过摇瓶发酵筛选高酶活力的重组菌株；在此基础上，研究重组菌在5L发酵罐中的高密度发酵，并将所得酶液进行辛伐他汀催化反应。结果：pPIC9K-LovD胞外表达重组菌的酶活是pA081 5-LovD胞内表达重组菌的3倍。筛选到酶活高的pPIC9K-LovD-3菌株进行5L发酵罐放大实验，经过96 h的甲醇诱导表达，酶活可达609.3 μL；发酵所得酶液冻干后进行酶功效实验，反应45 h后，其底物转化率可达96c70以上。结论：构建的毕赤酵母胞外表达菌株可高效表达洛伐他汀酰基转移酶，培养液上清杂蛋白较少，有利于后续分离和纯化，为洛伐他汀酰基转移酶的工业化生产奠定了基础。
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