作者：郑晓敏
研究发现FKBP52与多种癌症、生殖与神经系统相关疾病的发生发展密切相关。如在前列腺癌（雄激素相关）病人前列腺穿刺活检中可检测到高表达的FKBP52，在反复自然流产病人（孕激素相关）中FKBP52蛋白表达水平则显著降低；基因敲除实验还发现FKBP52可与病理性Tau蛋白相互作用介导神经系统退行性变。值得一提的是，FKBP52的小分子配体已被认为是潜在的营养神经药物。以上均提示FKBP52或可成为多种疾病的早期诊断标志物及潜在治疗靶点。因此，我们拟运用噬菌体抗体库技术，通过自行构建的大容量噬菌体抗体库，以FKBP52为抗原，筛选特异性人源抗FKBP52单恋抗体(scFv)，并进一步通过同源重组技术构建完整抗体的真核表达载体，为实现抗FKBP52人源抗体的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料
大肠杆菌XL- lBlue、HB2151菌株，辅助病毒VCSM13由本实验室保存；大容量噬菌体抗体库及含有轻、重链恒定区的pCMV-L和pCMV-H抗体真核表达载体由本实验室构建；FKBP52蛋白、亲环素A由美国科罗拉多州丹佛大学卡尔．K．爱德华教授惠赠；卵清蛋白(OA)和铁蛋白(Fer)购自Sigma公司；HRP标记的抗M13小鼠单抗购自GE公司；HRP标记的抗V5小鼠单抗购自Invitrogen公司；同源重组试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒抽提试剂盒购自promega公司；免疫管(Immuno-tube)购自NUNC公司；ELISA板购自CORINC公司。
1.2大容量噬茵体抗体工作库的制备及抗FKBP52噬菌体抗体的筛选
筛选所用大容量噬菌体抗体工作库由本实验室保存的原始抗体库制备，具体实验方法见文献。抗FKBP52人源抗体的筛选采用酸洗脱方法，实验步骤主要包括：将FKBP52蛋白用包被液(0.1 mol/LNaHCO、35 mL,O.1 mol/L Na2C03 15 mL，H20 50mL)稀释至50 μg/mL，包被免疫管，4℃过夜后用5%的脱脂奶粉370C封闭3h，加入1 mL制备好的噬菌体抗体库，37C孵育3h，用含l% Tween的PBS洗15次，加入1 mL甘氨酸盐酸(pH2.2)洗脱(37℃10min)，Tris碱中和后加入1 mL XL-IBlue，37。C、15min，转入锥形瓶并取10μL铺含氨苄西林(Amp)的培养盘测定菌落形成单位(CFU)，锥形瓶于37℃摇床培养约th后补足含Amp的SB培养基至100mL，370C、200 r/min培养Sh后加入VCSM13，30。C培养过夜，次日离心收集上清，PEG、NaCl沉淀后得级次噬菌体抗体库，加入免疫管进行第2轮筛选，如是筛选4轮。计算每轮获得的噬菌体抗体库的滴度，通过计算每轮抗体库投入和产出比（富集率），评价抗FKBP52噬菌体抗体的筛选是否有富集。
1.3噬茵体抗体的筛选及特异性鉴定
分别从第3、4轮筛选的含Amp的培养盘中随机挑取单克隆，置于含Amp的LB培养液中，于37℃摇床培养至对数生长期后加入VCSM13诱导感染，30℃培养过夜后离心取上清即得到噬菌体抗体。
噬菌体抗体特异性鉴定采用ELISA方法：稀释FKBP52抗原至5 μg/mL，50μL/孔包被ELISA板，4℃过夜，用5%脱脂奶粉于37℃封闭3h后加入噬菌体抗体，37C孵育2h，用含1% Tween的PBS洗后加入二抗（HRP抗M13小鼠单抗），37℃孵育2h，洗涤后加入TMB底物显色液显色，用酶标仪读取D450nm值，根据读数选出阳性克隆，再以OA、Fer为抗原包被ELISA板，以测定噬菌体抗体的特异性。
1.4噬菌体抗体可变区基因DNA序列测定
挑选出经上述步骤筛选到的特异性阳性克隆送诺赛公司测序，运用相关软件对获得的阳性克隆进行序列分析。
1.5 抗FKBP52-scFv的可溶性表达及检测
将序列分析后基因型不同的噬菌体抗体按照文献所述步骤感染新鲜培养的HB2151菌后，挑选单克隆于37℃培养至对数生长期，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(1 mmol/L)于30℃诱导培养过夜后离心收取上清，获得可溶性FKBP52-scFv。采用ELISA方法对对可溶性抗体进行特异性检测，无关抗原除OA、Fer外增加亲环素A。实验中一抗为可溶性上清，二抗为HRP抗V5小鼠单抗（针对载体上含有的14个氨基酸残基的V5标签：Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr),其余步骤同噬菌体抗体特异性测定。
1.6抗体的亲和力测定
抗体一抗原亲和力检测采用生物膜干涉( bio-laver interferometrV，BLI)法，由北京拓普百奥科技公司用ForteBio公司的RED96型生物分子相互作用仪进行测定，所得结合动力学曲线采用FortebBio数据分析软件以1:1模型拟合获取结合常数(kon)、解离常数（Kd）和亲和常数(KD)。
1.7 完整抗体轻、重链真核表达载体的构建及鉴定
1.7.1 完整轻、重链真核表达载体的构建
采用同源重组的方法。根据筛选获得的scFv轻、重链可变区设计相应上、下游引物，PCR分别扩增轻、重链可变区基因，用同源重组试剂盒分别与轻、重链真核表达载体pCMV-L和pCMV-H进行同源重组，将重组产物转化大肠杆菌DH5仪感受态，铺卡那霉素( Kan)抗性盘，37℃孵育过夜，获得完整抗体真核表达载体。
1.7.2 完整轻、重链真核表达载体的阳性克隆的鉴定
采用常规菌液PCR方法，随机挑选Kan盘上单克隆菌为模板，扩增可变区及完整抗体片段，选择经PCR方法鉴定为阳性的克隆送诺赛公司测序。
2结果
2.1 实际工作库的制备
用原始库超感染BS1365菌后得到的次级库滴度为1.26x1013，再用其感染对数期XL-IBlue菌后得到的工作库滴度为5.OX1014，用于下步抗体筛选。
2.2抗FKBP52噬菌体抗体的筛选及鉴定
经4轮筛选，抗FKBP52噬菌体抗体的回收率达千倍富集（表1），分别从3、4轮随机挑选500个克隆制备噬菌体抗体，ELISA结果表明其中126个克降可与FKBP52结合，进一步的特异性测定表明其中45个克隆与OA、Fer蛋白等无关抗原不结合，其特异性克隆占35%。
2.3噬菌体抗体可变区基因DNA序列分析及可溶性表达
对获得的特异性克隆测序后对可变区DNA进行序列分析，发现46个阳性克隆具有15种不同基因型。将15种阳性噬菌体抗体上清感染HB2151菌获得可溶性表达，进一步进行特异性测定，其中7种获得可溶性表达（图1）。对这7种单链抗体可变区进行分析，其轻链可变区分属VKI、VKⅢ、V入I亚群，而重链可变区则分属VH I、VHⅢ、VHⅣ亚群。
2.4噬菌抗体的亲和力测定
从7种可溶性表达活性较高的阳性克隆中挑选4种进行亲和力测定，结果见表2。
2.5 完整轻重链真核表达载体的构建及鉴定
选择亲和力较好的克隆3，用同源重组方法分别构建轻、重链真核表达载体，经转化，各挑取10个克隆PCR鉴定，其中轻、重链阳性克隆分别为9和10个，阳性率分别为90%和100%；进一步挑选2个阳性克隆进行DNA测序，结果显示全部正确，图2为其中一个阳性克隆的PCR鉴定结果。说明已构建成表达完整轻、重链的真核表达载体。
3讨论
FKBP52因其特征性的对甾体激素受体及中枢神经系统神经冗微管的调控功能而被证实与多种疾病存在关联。最新研究发现，其在前列腺癌、乳腺癌、肝癌中均有着显著的高表达，而在反复自然流产(RSA)、先兆子痫(PE)及胎儿宫内生长受限(IUGR)等生殖疾病中亦有着明显异常的表达。另外，其还在一定程度上介导Tau蛋白病的发生，且被认为参与了花青素潜在预防阿尔兹海默病(AD)的作用机制。种种研究均表明FKBP52可作为前列腺癌、乳腺癌、肝癌的早期诊断标志，且有望成为上述癌症及生殖相关疾病的治疗靶点。此外，对
FKBP52表达水平早期测定有助于预测AD的发生，而针对提高FKBP52活性的药物还可能成为预防及治疗AD的有效手段。故研制针对FKBP52的人源化抗体有着非常实际的应用价值及发展前景，同时也有助于更好地深入评价其功能。
噬菌体抗体库技术是起源于上世纪90年代的一种人源抗体制备技术，因其操作简便、快速等特点，在早期针对新型治疗靶点人源抗体的制备及评价方面有良好的应用前景。为进一步探讨FKBP52作为自身免疫性疾病治疗靶点的潜质，我们使用本室自行构建的大容量噬菌体scFv抗体库，通过吸附、扩增、洗脱过程筛选抗FKBP52的噬菌体抗体，经ELISA测定、DNA序列分析，获得了多株具有不同基因型的抗FKBP52人源scFv。基于以往研究经验，为了避免噬菌体抗体基因Ⅲ蛋白对scFv结构的影响造成的假阳性，我们进一步对获得的噬菌体抗体进行了可溶性表达，最终获得了7株基因型不同的特异性抗体。同时，我们挑选特异性结合活性高的4株进行了亲和力测定，结果显示亲和力均在10-8范围内，尚未达到可用的10-9，符合噬菌体抗体筛选的普遍特性，可能与scFv同抗原结合单价相关，有待表达完整抗体后再进行亲和力测定，相关工作正在进行中。
噬菌体抗体技术作为一种成熟的T程抗体制备技术，已被广泛用于特异性抗体片段的制备中，但由于制备的仅是抗体功能片段，半衰期短，加上多为原核表达载体，抗体片段蛋白没有经过蛋白翻译后修饰，很难满足治疗性抗体需要，因此必须将筛选获得的抗体片段转换为真核表达的完整抗体分子。以往进行真核表达载体构建时多采用酶切的方法，但往往耗时长、连接效率不高。在本研究中，我们选择亲和力较好的一株scFv，采用同源重组方法进行了完整抗体真核表达载体的构建，并通过了PCR验证及测序确证。重组方法操作简便、快速且成功率高，为将抗体库筛选获得的小分子抗体转换为完整抗体提供了新方法。目前我们已在HEK293-F细胞中表达了完整抗FKBP52人源抗体，正在对获得的抗体进行分离纯化及功能测定，结果将后续报道。
4[摘要] 目的：从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗FKBP52人源单链抗体，并进一步构建其真核表达载体。方法：以FKBP52为抗原，通过吸附、扩增、洗脱等过程，从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性单链抗体，采用ELISA方法进行特异性测定，采用生物膜干涉方法测定亲和力，再经同源重组方法构建完整抗体的真核表达载体，通过PCR及序列测定对构建的载体进行验证。结果：经过4轮筛选，获得15种与FKBP52特异结合的噬菌体抗体，其中7种得到可溶性表达；序列分析表明，7种单链抗体重链可变区分属VHI、VHⅢ和VHⅣ亚群，轻链可变区分属VKI、VKⅢ和VλI亚群；特异性结合活性较好的4株抗体的亲和常数分别为9.723x10-8、3.500x10-8、1.203x10-8和5.323xl0-8；将亲和力较好的一株单链抗体轻、重链可变区基因分别拼接到含有人K及IgG1恒定区基因的pCMV-L和pCMV-H真核表达载体中。结论：筛选获得多株人源抗FKBP52单链抗体，并构建了完整抗体的真核表达载体。
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