作者：郑晓敏
艾比湖位于亚欧大陆腹地，是新疆面积最大的咸水尾闾湖泊，属典型的荒漠湿地生态系统，地处干旱及著名风区阿拉山口下风向。特殊的气候条件使得湿地生态环境体系脆弱，对气候的变化具有较强的敏感性，湿地盐渍化严重，植物群落结构相对较简单。艾比湖湿地复杂的生态系统中，动物、植物、微生物及一些非生物因素通过一系列相互作用共同维系着湿地生态系统的平衡。
土壤微生物是湿地土壤生态系统和功能的重要组成部分，与土壤的结构、通气性、水分状况、养分状况等有密切的关系，湿地土壤微生物的生长繁殖与环境相关，而植物根际土壤微生物尤为丰富。根际微生物作为湿地生态系统的调节者，参与湿地生态系统中物质的循环和能量的流动等各个方面。放线菌作为根际微生物的重要成员，能够改善土壤的养分状况，便于植物充分吸收利用。艾比湖湿地的微生物多样性调查显示，放线菌菌群多样性丰富。目前，针对植物根际微生物以及与土壤理化相关性的研究报道较少。分子生态方法证明根际微生物含有大量未培养的微生物种群。本研究利用免培养技术对不同季节艾比湖湿地3种不同植物根际土壤放线菌多样性进行研究，结合土壤理化因子之间的关系，阐明放线菌多样性与土壤理化因子的相关性以及在植物结构布局中所起的作用，为明确放线菌在艾比湖湿地中的生态角色及在生态功能调节中的地位及湿地生态环境平衡、恢复和改良奠定一定的理论依据。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1样品采集
以艾比湖湿地国家自然保护区中精河盐场漫滩区和博乐河入湖口观鸟台草甸区（图l色圈内区域）为研究样区，选取具艾比湖有代表性的3种不同植被类型（盐节木、芦苇和盐角草群落）作为样地。采样地地理位置及样品采集概况见图l和表1。在每个样地水平方向上10 mxlo m的样方内用5点采样法，随机对同一植物根际进行采样。采样前先剔除地表植被和枯枝落叶，去除表面2 cm左右的表土，同一样地5点土样充分混合作为1个样品。分别在春季（2013年5月20日）、夏季（2013年7月25日）、秋季（2013年ll月8日）3个季节采集湿地土壤样品。
将新鲜土样进行如下处理：(l)装入铝盒，用于土壤含水量的测定。(2)室内自然风干、研磨、过筛(100目用于pH、电导率和有机质的测定，20目用于碱解氮、有效磷和速效钾的测定），用于土壤理化因子的测定。(3)-20℃冰箱保存，用于土壤总DNA的提取。
1.1.2试剂及仪器
东胜2x浓缩的PCR Mix（含溴酚蓝）、纤维素酶、溶菌酶、PVPP、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基二已胺、普通DNA产物纯化试剂盒（天根）、常规试剂用分析纯。
电子分析天平ALC-210.2、超纯水器CPR-M( Millipore)、高压蒸汽灭菌消毒锅MLS - 3030ch(SANYO)、旋涡混合器WH-3、电热恒温水浴锅ZX-3D、台式冷冻离心机Centrifuge（德国Eppendorf）、PCR仪Hamburg(德国Eppendorf)、水平电泳仪EPSlOO( Tanon)、变性梯度凝胶电泳仪(Bio-Rad laboratories．Hercules)、凝胶成像仪HOODII（美国Bio -Rad）等。
1.2实验方法
1.2.1理化因子测定
土壤含水量采用烘干法l91测定；电导率用电导率仪测定；pH值用校准的pH计（Sartorius PB-21）测定；土壤有机质用重铬酸钾氧化一油浴加热法测定；碱解氮采用碱解扩散法测定；有效磷采用钼锑抗比色法（浸提剂为碳酸氢钠）测定；速效钾用火焰原子分光光度计法测定。
1.2.2艾比湖湿地3种植物根际放线菌多样性及菌群结构组成分析
(I)DNA的提取和16S rDNA的扩增。土壤总DNA参照Yang Zh H等的方法采用TENP-PBSbuffer预处理再用SDS-酚氯仿抽提法进行提取，并用genomic DNA试剂盒纯化。
采用能特异性扩增放线菌l6S rRNA基因V3区的通用引物F243/R513对土壤总DNA进行PCR扩增。在下游引物R513的5’端设置GC夹子，应用引物F243/GC_R513进行放线菌16S rRNA基因V3区的DGGE多样性分析。引物及GC夹子序列见表2。
PCR反应体系（25 μL）：PCR-Mix 12.5 μL(含有0.1 U Taq DNA聚合酶、400 Um dNTPs、缓冲液(100 mmol/L KCI, 20 mmol/L Tris-HCI)、3 mmo/L MgCl2、溴酚蓝）；DNA模板lμL;上下游引物（10 μμmol/L）各1μL;双蒸水9.5 μL。
PCR反应条件：94℃5 min;35个循环(94℃50 s．63℃1 min，72℃l min)；72℃延伸10 min;4℃保温。扩增后的PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)艾比湖湿地3种植物根际放线菌的DGGE图谱多样性分析。用Bio-Rad公司基因突变检测系统对各样本PCR产物进行变性梯度凝胶电泳。DGGE胶的配制：8%的聚丙烯酰胺凝胶，40%—60%的变性剂梯度（100%变性剂是7 mo/L的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合液）。上样量为12 μL。电泳条件为：在l/IAE缓冲液中180 V恒定电压、60℃恒温下电泳6h。银染。用凝胶成像系统观察凝胶上的条带并拍照。
DGGE图谱用Quantity One软件(Bio-Rad)进行分析，对图谱中各个样品中条带的数量、迁移率以及灰度进行数字化定量，并构建示意图。采用UPGMA法对DGGE图谱各样品条带的谱型的相似性进行聚类分析，并采用Shannon指数(H)、均匀度指数(E)、丰富度指数(S和辛普森指数(D)来评价3种植物根际土壤放线菌的多样性。
式中：S为样本中DGGE图谱的条带数目；Pl为第f个条带的优势度，即第i个条带的灰度峰值占该样品总灰度峰值的比率。
(3)艾比湖湿地3种植物根际放线菌优势菌群结构组成及系统发育分析。选择各样本DGGE胶上亮度大的条带进行切胶，把切下的凝胶用无菌水冲洗后浸泡在30 μL的TE中，4℃冰箱过夜，取lμL为模板，用引物F243/R513（不带GC夹）进行PCR扩增，扩增产物送北京志远生物技术有限公司测序。
用DNAMAN软件对测序结果进行同源性比较，登陆NCBI，在GenBank数据库中用BLAST进行相似性搜索，获取相近典型菌株的l6S rDNA序列。利用ClustaIX和MEGA5.05软件，将测序序列与其相似序列用邻接法构建系统发育树，并分析放线菌优势菌的可能归属。
1.2.3数据处理和相关性分析
采用Microsoft Exce12000．SPSSIl.O软件对样本理化因子进行相关性分析；利用Canoco软件进行艾比湖湿地3种植物根际放线菌多样性指数与环境间的PCA分析。
2结果
2.1艾比湖湿地3种植物根际土壤理化因子的差异变化
结果表明，盐节木根际土壤pH值、电导率、速效钾含量均显著高于芦苇和盐角草根际土壤（表3），其中pH值与季节呈极显著的负相关，而电导率与季节呈正相关，与样地差异不显著；速效钾含量与样地呈负向显著相关关系，而与季节差异不显著（表4）。在不同的季节，有效磷和碱解氮含量均为盐节木根际土壤最高，而含水量为芦苇根际土壤最高（表3），在样地和季节方面均无显著差异（表4）。芦苇根际有机质含量最高，在春秋两季高达17.57%和16.50%，而盐节木根际较低，其中在夏季土壤中低至1.47%（表3），与样地和季节差异不显著（表4）。
2.2艾比湖湿地3种植物根际土壤放线菌DGGE图谱的茵群相似性分析
3种植物根际土壤放线菌l6S rDNA V3区PCR扩增结果见图2。目的片段长度为270 bp左右。各样本扩增片段条带清晰，均可作为变性梯度凝胶(DGGE)电泳的样品。样品DGGE图谱用Quantity One软件处理后的示意图见图3。对DGGE图谱用UPGAM法聚类（图4），并得到相似性Cs值（表5）。由图4可见，1、2和4聚为一类，3、5、6、7、8和9聚为一类。结合表5各样品放线菌群落相似性矩阵可以发现，盐节木根际春季和秋季（1和3号）的相似度最低，Cs值为26.g%，而芦苇和盐角草两种植物根际土壤在不同季节菌群相似性较高，Cs值均在50%左右。在季节方面发现，仅在秋季时，3种植物根际（3、6和9号）土壤放线菌群落相似性较高，Cs值分别为68.3%，72.7%和69.5%。
2.3 艾比湖湿地3种植物根际土壤放线菌DGGE图谱的茵群多样性分析
各样品土壤放线菌多样性指数计算结果见表6。盐节木根际（1、2、3号）放线菌Shannon-Wiener多样性指数在3.033 3-3.353 5的范围内变化，平均值为3.208 7，其中最大值出现在夏季（2号），均匀度指数、丰富度指数和辛普森多样性指数也是夏季较大。芦苇根际（4、5、6号）放线菌Shannon多样性指数在3.244 7-3.422 1内变化，平均值为3.316 6，其中多样性指数、丰富度指数和辛普森多样性指数均为夏季（5号）最大，但均匀度指数春季（4号）最大，夏季最小；盐角草根际（7、8、9号）放线菌Shannon-Wiener多样性指数在3.118 0-3.514 0范围内变化，平均值为3.316 7，且随春夏秋季节的变化，依次增大（7号<8号<9号），辛普森指数和丰富度指数也依次增大，均匀度指数在夏季出现最大值1.030 6。总之，艾比湖湿地盐角草根际放线菌最丰富，芦苇次之，盐节木最低。
2.4艾比湖湿地3种植物根际放线菌优势菌群结构组成及系统发育分析
在DGGE分离后的条带中，选取其中荧光强度亮的条带切胶，测序。最终得到22条序列如图5所示的位置，编号为S.eSp-l-Ph.aSp-3。将测序序列提交到GenBank数据库，登录号为KM205541-KM205562。在GenBank中使用Blast程序进行同源性比较，获得相似性最高模式菌株的16S rDNA序列如表7所示，将序列经Clustal X比对后用MEGA 5构建系统进化树（图6）。l6S rRNA基因序列分析结果表明，22条序列分布在放线菌门放线菌纲7个亚目、未知的放线菌目和未知的细菌类群（见表7）。根据这些DGGE带谱所代表的放线菌即可判定不同样品中优势放线菌群落的组成状况。
由图5可见，1-9号样品扩增条带的数目、强度和迁移位置存在一定的差异，其中条带S．eSp-3、S．eAu-4、Ph.aSp -4为9个样品的共有条带。S.eSp -3与uncultured Acidimicrobineae的相似度为8g%，S．eAu-4与Blastococcus sp.的相似度分别为gg%，Ph．aSp-4与Rhodococcus thodochrous相似度为97%，说明未知的酸微菌类群(Actinobacteria)、芽球菌属(Blastococcussp．)，红球菌属（Rhodococcus thodochrous）普遍存在于艾比湖湿地根际土壤中；条带S．eSp-l、S．eSu-l、S.eSu -3、S.eSu-5、S.eAu -l、S.eAu -3、Ph.aSp -l、Ph.aSp-3、Ph.aSu-3、Ha.sSp-l、Ha.sSu-l、Ha.sSu-2和Ha.sSu-3在3种植物根际土壤中均有出现，但随季节的变化，在某个季节土壤中缺失，分别属于未知的细菌类群( uncultured bacterium)，未知的放线菌类群( uncultured actinobacterium)，放线菌亚目( Actinomycinea)，弗兰克氏菌亚目（Frankineae），微单孢菌亚目( Micromonosporineae)和棒杆菌亚目( Corynebacterineae)；条带S.eSp-2仅出现在盐节木根际的春秋两季（1、3号）的样品中，为未知的细菌类群；条带Ph.aSu-l出现在盐节木和芦苇根际(2、3、4、5、6号)的样品中，与孢鱼菌科(Quadrisphaera sp. THG-DMl)相似性为94%，即动孢菌亚目(Kineosporiineae)出现在盐节木和芦苇根际土中；条带Ha. sSu-4为盐角草根际夏季特有的条带．属于未知放线菌类群；条带Ha.sAu-4仅出现在3种植物根际的秋季（3、6、9号）样品中，与血杆菌属(Sanguibacter sp．NH20)的相似度为93%，说明微球菌亚目(Micrococcineae)仅存在于根际土壤的秋季；条带Ha.sAu-5在3种植物根际的春季土中均没有出现，与登录号为JX242823的未知放线菌类群(Actinomycetales)的相似度为94%。
2.5艾比湖湿地3种植物根际放线茵多样性指数与环境间随季节变化的相关性分析
由图7的主成分分析(PCA)可知，放线菌种群的多样性与土壤理化因子之间的相关性，不同理化因子对放线菌物种群落结构和多样性等方面的影响不同，放线菌种群多样性变化与理化因子的相关性顺序依次为：电导率>速效K>有机质>碱解N>有效P>pH>含水量，其中有机质含量和含水量与放线菌多样性呈正相关；而速效K、碱解N、有效P、pH以及电导率等理化因子与放线菌的多样性呈较强的负相关。通过图7观察样品的聚集、离散程度，样品分布点越靠近，说明这些样品中所含的变量的组成和结构越接近；反之，样品点越远离，其差异越大。本研究中各样品均比较离散，但秋季样品（3、6、9号）较集中，春季样品(1、
4、7号)分布于一边，7号较离散，2、8同在第2个象限，较离散。
3讨论
本研究采用PCR-DGGE技术分析艾比湖湿地植物根际土壤放线菌l6S rRNA基因，发现艾比湖湿地典型植物根际土壤非培养放线菌群落多样性为盐角草群落>芦苇群落>盐节木群落，刘绍雄等的研究也表明植物群落类型与土壤放线菌多样性的关系十分密切，贾鳗等在对艾丁湖地区的放线菌资源的研究中发现高盐环境中含有更多的高级未分类单元，由于盐角草又是地球上迄今为止报道过的最耐盐的陆生高等植物种类之一，所以盐角草根际放线菌资源更丰富。盐节木虽是耐盐植物，但本研究发现盐节木根际土壤含水量最低，除了盐分，含水量可能是影响放线菌群落多样性的另～重要要因素，故盐节木根际土壤放线菌多样性较低。徐莉等研究发现芦苇群落土壤随土层加深，盐分含量降低，在0—5 cm时的盐分比10～60 cm时降低了约30%，本研究样品为35 cm左右处的根际土壤，土层较深受季节的影响较小，同时芦苇群落离湖面较近，含水量最高，其根际土壤放线菌群落较稳定，比盐节木丰富。
本研究中DGGE图谱的Cs相似性和聚类分析显示，秋季3种植物根际土壤放线菌群落相似度较高，尤其盐节木和盐角草Cs相似度高达72.7%，可能原因是盐节木和盐角草都为典型的耐盐碱植物，另外秋季随气温骤降，植物代谢变慢，根际微环境中的养分积累，适应该环境的放线菌物种迅速繁殖，从而使秋季根际土壤中优势放线菌菌群发生变化，即秋季3种植物根际土壤放线菌类群相似性升高，尤其是耐盐植物盐节木和盐角草。
土壤样品理化性质研究表明，不同植物根际土壤样品的理化性质存在显著差异，且随季节变化发生变化。放线菌多样性指数与土壤理化因子相关性分析表明有机质含量和含水量与根际放线菌多样性呈正相关，XuZX等研究发现土壤水分含量和碳源供给是影响微生物群落的主要因素。Doran等又提出了土壤中放线菌密度越高，土壤养分水平越高；贾倩民等提出有速效钾、效磷和碱解氮含量与放线菌数量呈显著或极显著正相关；而本研究中放线菌多样性指数与速效养分（速效钾、有效磷和碱解氮）呈负相关，根据黎宁等的研究土壤养分比例，特别是有效磷碱解氮之比会影响土壤微生物的生长活动，偏高的有效磷／碱解氮比例对微生物生长不利，而本研究中样品有效磷含量在110 mg/kg左右，而碱解氮含量仅在60-80 mg/kg，即有效磷／碱解氮比例较高，故放线菌多样性指数与有效磷和碱解氮呈负相关。速效钾含量在140-440 mg/kg之间，随不同植物根际和季节变化幅度较大，可能原因是由于植物生长的不同阶段对矿质元素、阳离子的选择性吸收，同时土壤酸碱性对土壤元素的有效性，土壤离子的交换、运动、迁移和转换都有直接影响，以及土壤通气性、土壤总盐含量等，造成根际放线菌多样性的变化，另一个重要的原因是DGGE技术通常只能检测到环境中的优势菌群，而对于数量较少的种群却无法准确检测。放线菌群落多样性的季节变化也会受温度等物理环境因子的影响，由于新疆的冬季严寒又漫长，春季土壤放线菌多样性指数明显低于夏秋两季，同时也说明放线菌群落多样性有较明显的季节性变化。
系统发育分析表明，供测序的DGGE条带为酸微菌亚目( Acidimicrobineae)、放线菌亚目(Actino -mycinea)、弗兰克氏菌亚目(Frankineae)、微单孢菌亚目( Micromonosporineae)、棒杆菌亚目(Corynebacter-ineae)、动孢菌亚目(Kineosporiineae)、未知放线菌门和未知细菌类群，其中大部分是不能归类的未培养类群，这一结果充分显示艾比湖湿地放线菌群落中蕴藏着极为丰富的不可培养和未被描述的类群。9个样品中均存在红球菌属、芽球菌属和未知的酸微菌类群，其中红球菌属被定义为海洋特有放线菌，曾在新疆焉耆盐场也被发现，而其在艾比湖湿地植物根际土壤样品中却普遍存在；常在岩石样品中才可发现的酸微菌亚纲也存在于艾比湖湿地土壤；放线菌亚目、微球菌亚目、微单孢菌亚目和弗兰克氏菌亚目均是荒漠耐盐植物根际土壤放线菌群落的优势成员，很可能是重要生态功能的“执行者”，之前研究发现在海洋沉积物、沙漠地区的沙尘和稻田样本中均有分布，但它们还存在于石头以及阿尔卑斯山或喜马拉雅山等贫瘠的环境中。王孝国等在对艾比湖湿地植物区系的可培养放线菌的研究中发现，链霉菌属（Strepto -myces sp.）和拟诺卡氏菌（Nocardiopsis sp．）属占优势，还有欧文菌属（Erwinia sp.）.flavisolibacter、Massilia、放线菌北里属（Kitasatosporia sp.）等，甚至有一些嗜热、嗜冷和嗜盐碱的放线菌，进一步说明艾比湖湿地根际放线菌类群极为丰富，有待进一步探索，从中挖掘新颖的放线菌资源，并深入研究其生态功能。
4摘要：分别在春、夏、秋3个季节采集新疆艾比湖自然保护区盐节术、芦苇以及盐角草3种不同植被的根际土壤，利用PCR-DGGE技术研究土壤放线菌群落结构及多样性，同时测定7个理化因子，并对放线菌多样性与土壤理化因子的相关性进行分析。结果表明，艾比湖湿地不同植物根际、不同季节的放线菌多样性存在明显差异，其中盐角草群落放线菌的多样性最高，芦苇群落次之，盐节木群落最低；在盐节木和芦苇根际土壤中放线菌的多样性为夏季>秋季>春季，而盐角草根际土壤放线菌的多样性随春夏秋季节的变化依次增大。DGGE图谱中共测序22个条带，主要为放线菌亚目、微球菌亚目、弗兰克氏菌亚目、酸微菌亚目、棒杆菌亚目、动孢菌亚目和细菌域的未知类群。Shannon指数与土壤有机质含量、含水量呈显著正相关；与电导率.pH值、速效钾、有效磷和碱解氮等呈负相关。
下一篇:返回列表
