关于硒的酶催化荧光猝灭效应研究及其在土壤分析中应用的研究

作者：张毅

  近年来，随着酶的理论与实际应用的发展，酶法分析已成为分析化学的一个重要分支，辣根过氧化物酶( HRP)是从植物中提取的一种重要的酶制剂，被广泛应用于生物工艺技术、生物传感器及有机合成等领域。介质环境对HRP催化荧光反应体系的影响已有报道，HRP在NH。．H：O-NH。Cl碱性缓冲环境(pH 9.5)下不变性而表现出高的活性，是由于氮配体NH。的存在拓宽了HRP的活性pH范围。L-酪氨酸(L-Tyr)在HRP催化下可被H2 02氧化为二聚体的强荧光物质，实验发现痕量硒对该荧光体系具有较强的猝灭作用，据此建立了测定痕量硒的酶催化荧光猝灭法。

1  实验部分

1.1  仪器和主要试剂

    FP-6500型荧光光谱仪（日本Jasco公司）；pHS-3C型酸度计（上海理达仪器厂）；电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

    硒(Iv)标准储备溶液：1 000 ptg／mL，称取0.109 5 g优级纯Na：Se0。（上海第一试剂厂）溶于100 mL水中配制而成；硒㈣标准溶液：100ug/mL，使用时用硒㈣标准储备溶液逐级稀释而成；HRP溶液：5.00×10-6mol／L，由HRP（酶活性为250～330 U／mg，酶纯度Rz一3．O）配制而成；0Tyr溶液：5.00×10 4 mol／L; H202（）：10. 60 mol／L，由高锰酸钾标准溶液标定；H202：1.00×10-3 mol／L，由H。q配制而成，棕色瓶装，现用随配；NH3．H20-NH4Cl缓冲溶液(pH10.0)：由0.1mol／L NH4 Cl溶液和0.1 mol／L NH3．H20溶液在pH计下混合配制而成。

    所有试剂均为分析纯；实验用水为二次石英亚沸水。

1.2  实验方法

    取两支刻度一致的10 mL具塞比色管，向其中一支加入0. 40 mL 100 ug/mL硒㈣标准溶液，另一支不加（试剂空白），依次加入2.00 mL pH 10.0的NH3．H20NH4Cl缓冲溶液、1.50 mL L-Tyr溶液、1. 00 mL HRP溶液、1.00 mL 1.00×10 3 mol／L H202,用水定容。在室温下反应20 min，在选定的激发波长314 nm和发射波长404 nm下，测定其荧光强度，计算荧光猝灭值AF= Fc, -F，。其中：F。为试剂空白即不加硒㈣标准溶液体系的荧光强度，Fi为加硒㈣标准溶液体系的荧光强度。

2  结果与讨论

2.1  荧光光谱

按图1所示的系列溶液和实验方法操作，在荧光光谱仪上扫描并绘制荧光光谱。由图1中曲线0与0 7可看出，在HRP的催化作用下，H2 02能够氧化/_-Tyr反应产生荧光，反应产物的最大激发和发射波长分别为。由图1中曲线1和1’、2’和2 7、3和3 7对比可知，当体系中加入不同浓度的硒㈣标准溶液时，体系的荧光强度显著降低，表明硒㈣对H202氧化L-Tyr的荧光体系具有明显的猝灭作用。进一步研究表明，体系AF和硒㈣的质量浓度呈线性关系。

2.2  测定条件的优化

2. 2.1  缓冲体系和酸度

    酸度对酶促反应的影响是多方面的，如强酸或强碱介质都可以使酶的空间构象发生改变，使酶失活；另外，酸度可改变底物的解离状态，影响它与酶的结合。因而，酸度是酶（或模拟酶）促反应需要用缓冲溶液严格控制的条件之一。为此，试验比较了NH3 -NH4Cl、Tris - HC1、Naz C03 -NaHC()3、Na2 HP04-NaH2 P04、甘氨酸NaOH、硼砂-NaOH等缓冲体系对荧光反应的影响。结果表明：HRP催化H2 02氧化L—Tyr的荧光反应体系在碱性环境中荧光量子产率比在酸性环境中要高；对于碱性环境来说，体系在NH3一NH4Cl缓冲体系中的荧光强度又比在Na2 CO3NaHC03缓冲体系中强，这可能是因为HRP的催化反应可被NH3配体所增强。在pH 9～11范围内进行试验。结果发现，在选定的N H:a -NH。Cl缓冲体系中，随着pH的增大，硒㈣对荧光体系的猝灭作用先增大后减少，且在pH 10.0时AF值最大。因此，反应介质选择pH 10.0的NH3-NH4Cl缓冲溶液。进一步试验发现，当pH 10.0的NH3-NH4Cl缓冲溶液加入量为1.5～3.5 mL时，AF值最大且稳定。实验选用2.0 mL pH 10.0的NH3-NH4Cl缓冲溶液。

2.2.2   L-Tyr溶液用量

    改变5. 00×10'4 mol／LI-- Tyr溶液的用量(0. 50～2.50 mL)进行试验。结果表明：当L-Tyr

的浓度增大时，硒㈣对体系的荧光猝灭程度先增强后减弱；当L_ Tyr溶液浓度为7.50×lO-5 mol／L时AF最大。因此实验选用1.50 mL /_-Tyr溶液为最佳用量，此时体系中L—Tyr的质量浓度为7.50×10-5 mol／L。

2.2.3     Hz Oz用量

    H2 02在反应体系中作为氢受体底物，它的浓度直接影响到反应的速度和完全程度。当H2 02的浓度过低时，其氧化L- Tyr的反应不能完全。按实验方法，改变H2 02的用量进行试验，结果表明，当1.00×10-3 mol／L H2 02用量为0.9～1.2 mL时，AF最大且稳定。实验选用1.00 mL 1.00×101 mol／L H2 02溶液，此时体系中H202浓度为1.00×10 4 mol／L。

2.2.4    HRP溶液用量

    当HRP浓度很低时，在测定时间内催化反应不完全。试验表明，当HRP浓度在2.0×10-7～6．0×10。7mol／L时，体系AF最大且稳定。实验选择1.00 mL 5.00×10-6 mol／L HRP溶液，此时体系中HRP浓度为5.00×l0-7mol／L。

2.2.5  反应时间

    在实验选定的条件下，反应20 min时AF值达到最大且稳定，并在50 min内保持恒定。故实验选择反应20 min后测定。

2.3  校准曲线和检出限

    在上述确定的实验条件下，按照实验方法加入不同体积的硒㈤标准溶液，测定并绘制校准曲线。结果表明，硒㈣的质量浓度在0.1～10.0ug/mL范围内与AF呈线性关系。用最小二乘法回归处理，得到校准曲线的线性回归方程为AF =83. 123 ps。㈣（ug/mL）+0. 068 5，相关系数r=0. 999 5。按实验方法对4.0ug/mL硒㈣试液进行11次测定，相对标准偏差为2.9%。在同样条件下对空白溶液连续测定11次，以其3倍标准偏差计算方法中硒检出限为0. 03 ug/mL。

3  样品分析

    取富硒土壤样品，于室内自然风干，剔去大根系及杂物，四分法缩分样品，用木锤研碎后过2 mm尼龙筛，研磨过100目(0. 147 mm)筛。称取晾干研磨过的50.0 g（精确到0.000 1 g）土壤样品于150mL三角消化瓶中，加入40 mL硝酸一高氯酸(V(HN03)：V(HCl04)=3：2）混合酸，盖上小漏斗，放置过夜。次日于160℃自动控温消化炉上，消化至棕黄色烟雾消失土壤颜色发白（如消化不完全，补加适量硝酸一高氯酸混合酸再消化）。继续消化至冒尽白烟后，继续加热，2 min内取下，稍冷后向消化瓶中加入10 mL 6.0 mol／L盐酸，置于沸水浴中加热至溶液大约剩余5.0mL，取下消化瓶，稍冷，将消化液趁热过滤于10 mL容量瓶中，冷却，定容，摇匀，待测。移取适量待测液，按实验方法进行测定，并采用AAS进行比对试验，同时进行加标回收试验，结果见表1。由表1可见：测定值与AAS基本一致，相对标准偏差（RSD，n=6）为1.6%～3.2%，回收率在98%～103%范围内。

4摘要：在氨性缓冲介质中，痕量硒㈣能阻抑辣根过氧化物酶( HRP)催化H202。氧化L，酪氨酸(L Tyr)产生荧光的反应。对该体系的荧光猝灭效应进行了探讨，并应用于土壤中痕量硒的测定。在pH 10.0的NH3、H20-NH。Cl缓冲溶液中，控制L- Tyr、H202。和HRP的浓度分别为7. 50×10-5mol／L、1.00×10-4mol／L和5.00×10-7mol／L，在室温下反应20 min后，于激发波长为314 nm，发射波长为404 nm处测定体系的荧光强度猝灭值(AF)。结果表明，硒㈣在质量浓度为0. 1～10.0ug/mL范围内与AF呈线性关系，线性回归方程为（ug/mL）+0.068 5，相关系数r一0.999 5。方法中硒㈣检出限为0.03ug/mL。将体系应用于测定富硒土壤样品中痕量硒㈣，测定值与原子吸收光谱法(AAS)相符，相对标准偏差（RSD，”一6）为1.6%一3.2%，加标回收率为98%～103%。